Quiste Toxoplasma gondii Muro de Formación en Activado médula ósea procedentes de los macrófagos y Condiciones bradizoíto
Summary
Toxoplasma gondii se convierte en una forma de quiste en respuesta al estrés ambiental, que puede ser imitado en los modelos de cultivo de tejidos. Este video muestra las técnicas para examinar la formación de la pared del quiste mediante la activación de médula ósea procedentes de los macrófagos o el cambio de pH de crecimiento medio en las células de fibroblastos.
Abstract
Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado que puede invadir cualquier célula nucleada de animales de sangre caliente. Durante la infección, T. gondii difunde como una forma de replicar rápida llamada de taquizoitos. Taquizoitos de convertirse en una forma enquistada de crecimiento lento llamado bradizoíto por un proceso de señalización que no está bien caracterizado. Dentro de los animales, los quistes bradizoíto se encuentran en el sistema nervioso central y el tejido muscular y representan la etapa crónica de la infección. La conversión a bradizoítos se pueden simular en el cultivo de tejidos de CO 2 de hambre, utilizando un medio con un pH alto, o la adición de interferón gamma (IFN). Bradizoítos se caracterizan por la presencia de una pared del quiste, a la que la lectina de Dolichos biflorus aglutinina (DBA) se une. DBA etiqueta fluorescente se utiliza para visualizar la pared del quiste en los parásitos cultivados en fibroblastos de prepucio humano (HFFS) que han sido expuestos a bajas emisiones de CO 2 y medio de alto pH. Del mismo modo, los parásitos que residen en el hueso murinas derivadas de la médula macrófagos (BMMs) muestran una pared del quiste detectable por DBA después de la BMMs se activan con IFN y lipopolisacárido (LPS). Este protocolo será demostrar cómo inducir a la conversión de T. gondii a bradizoítos utilizando un medio de pH alto crecimiento con bajas emisiones de CO 2 y la activación de BMMs. Las células huésped se cultivaron en cubreobjetos, infectados con taquizoítos y sea activado con la adición de IFN y LPS (BMMs) o expuestos a un medio de pH alto crecimiento (HFFS) de tres días. Al término de las infecciones, las células huésped se fija, permeabilized y bloqueado. Las paredes del quiste se visualizan mediante DBA rodamina con microscopía de fluorescencia.
Protocol
Discussion
Si bien el mecanismo de desarrollo bradizoíto no se entiende completamente, los análisis de genética molecular de T. conversión gondii etapa de cultivo de tejidos ha llevado al descubrimiento de genes que están involucrados en la formación de quistes bradizoíto 2,3,4. El análisis también dio lugar a la observación de que algunos marcadores bradizoíto se expresan en otras condiciones de estrés prolongado, como el crecimiento en los macrófagos activados 5,6. Los método…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate | |
| Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | ||
| Formaldehyde (16%) | Polysciences | 18814 | ||
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | ||
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | ||
| IFNγ | PeproTech | 315-05 | Store in single use aliquots | |
| L-glutamine (200mM) | Gibco | 25030 | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391-1MG | Store in single use aliquots | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | Gibco | 31800-022 | ||
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200 | ||
| VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).
- Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).
- J, P., Knoll, L. J. Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology. 169 (2), 120-123 (2010).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages. Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).
- Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner. Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).
- Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W. Toxoplasma gondii tachyzoite-bradyzoite interconversion. Trends in Parasitology. 18 (5), 198-201 (2002).
- Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).
- Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).
