Muismodellen van periventriculaire leukomalacie

Gedetailleerde procedures van het creëren van neonatale hersenletsel bij P6 muizen: Postnatale dag 6 (P6) muizen zijn verdoofd met indirecte koeling op ijs tot het punt van ongevoeligheid voor schadelijke stimulatie (diepe anesthesie). Na het reinigen van de huid met alcohol, is een middellijn ventrale incisie gemaakt in de voorste nek. Onder een microscoop ontleden, is de splitsing van de rechter a. carotis communis benaderd door voorzichtig het terugtrekken van de omohyoid en sternocleidomastoideus spieren. De fascia rond de halsslagader schede wordt verwijderd, en de proximale interne tak geïsoleerd van de nabijgelegen nervus vagus en de sympathische ganglia met een haak. De interne halsslagader wordt dan verbrand met behulp van een tip verbranden. Na de cauterisatie, wordt de huid incisie gehecht, en het dier wordt warm gehouden tot helemaal wakker en keerde terug naar de dam. Een uur na ligatie, is het dier in een afgesloten kamer doordrenkt met stikstof tot een niveau van 6,0% O 2 is bereikt. Het dier wordt vervolgens blootgesteld aan 35 min van hypoxie. Na blootstelling aan hypoxie, de muis herstelt van een verwarmingselement (33 ° C) gedurende 30 min en dan is het terug naar de dam. Voor het creëren van hersenletsel met gecombineerde hypoxie / ischemie en infectie / ontsteking, is het dier vervolgens intraperitoneaal geïnjecteerd met 0,015 ml van lipopolysaccharide (LPS, 1 mg / kg). Vier dagen post-hypoxia/ischemia, muizen verdoofd met indirecte koeling op ijs tot het punt van ongevoeligheid aan schadelijke prikkels, dan geperfuseerd met zoutoplossing en daarna 4% paraformaldehyde. Hersenen worden verwijderd en cryoprotected. Figuur 1. Karakterisering van hersenletsel in de hypoxische / ischemische muismodel met H & E kleuring. Er is focale necrose (pijlen) in de cerebrale witte stof ipsilaterale (A) naar de carotis ligatie, in vergelijking met de contralaterale cerebrale witte stof (B). Ipsilaterale necrose en focale microinfarcts worden waargenomen in de hippocampus (C) en de thalamus (D) in de hersenen met ipsilaterale cerebrale witte stof letsel. Representatieve resultaten en cijfers: Muismodellen van PVL met hypoxie / ischemie en / of infectie / ontsteking worden bereikt door eenzijdige carotis ligatie, gevolgd door de blootstelling aan hypoxie en injectie van LPS. We zijn het definiëren van de nieuwe muismodellen als geschikt PVL-modellen. Neuropathologisch onderzoek van coronale secties gekleurd met hematoxyline-en eosine (H & E) door het gehele voorhersenen onthult focale necrose in de centrale witte stof van de cerebrale hemisfeer ipsilaterale aan de carotis ligatie (Fig. 1A), met een relatieve sparen van neuronen in de bovenliggende cerebrale cortex in vergelijking met de contralaterale cerebrale witte stof (Fig. 1B). In het middelpunt necrotische witte stof, is er duidelijke toename van de cellulariteit bestaande uit macrofagen en reactieve astrocyten, zoals kenmerkend is voor de mens centraal PVL. In de contralaterale centrale witte stof zijn de oligodendroglia kernen gerangschikt in fascicular-achtige bundels, deze architectuur is volledig verstoord door de focale necrose aan de ipsilaterale zijde. Van de nota, We zien ook ipsilaterale necrose in de hippocampus (Fig. 1C) en de thalamus (focale microinfarcts) (fig. 1D) in de hersenen met ipsilaterale cerebrale witte stof letsel. Human PVL ook niet voorkomen in volledige afzondering van de bijbehorende grijze stof afwijkingen. Het kenmerk van PVL is de relatieve, hoewel niet volledig, gespaard van de cerebrale cortex bovenliggende de benadeelde witte stof – een functie die we geloven aanwezig is in onze muismodellen. Figuur 2. Scoren schaal van 0-5 voor het evalueren van witte stof letsel door MBP of O1 in muismodellen van periventriculaire leukomalacie. Onze muismodellen tonen kenmerken van PVL op zowel de fenotypische en moleculaire niveaus. Wij hebben gebruik gemaakt immunocytochemische detectie van myeline basic protein (MBP) of O1-antigeen om letsel te evalueren, hebben een standaard schaal van 0 tot 5 om de witte stof letsel (afb. 2) score, en hebben gekenmerkt de witte stof pathologie (Fig . 3). Meer recent heeft een niet-vooringenomen stereological test geïmplementeerd ter vervanging van de eerste semi-kwantitatieve methode. In aanvulling, om te testen op correlatieve effecten van de witte stof letsel op functionele uitkomsten, hebben wij controlewerkzaamheden uitgevoerd gedragstesten voor de motorische functie. We hebben aangetoond dat de muizen opvallende motorische stoornissen vertonen in P10-21 na hypoxie / ischemie plus LPS op P6. We hebben criteria scoren met een schaal van 0-4 tot contralaterale ledematen disfunctie definiëren gewond muizen op P10-21. Meestal kan normale muizen scamper tot een 30 ° helling (score van 4) en klim een ​​45 ° helling zonder glijden (score van 3). Gewonde muizen hebben een lagere scores in correlatie met de mate van witte stof letsel. Figuur 3. Karakterisering van witte stof schade door MBP of O1 vlekken en myeline structuur door elektronenmicroscoop (EM). MBP en O1 vlekken vertonen myeline verlies van cerebrale witte stof ipsilateraal aan de ligatie, in vergelijking met contralaterale witte stof. EM onderzoek blijkt gemyeliniseerde axonen in cerebrale witte stof contralateraal van de ligatie en gedegenereerde weefsel in ipsilaterale witte stof. We verwachten dat de oprichting van de nieuwe muismodellen van PVL zal ons toelaten om specifieke mechanismen van PVL-achtige letsel studie naar de onvolgroeide hersenen. We zullen pathogenese het gebruik van transgene muizenstammen de rol van individuele moleculen van belang te onderzoeken en doelstellingen van neuroprotectie te evalueren.