Los modelos de ratón de la Retinopatía

Los procedimientos detallados de la creación de una lesión cerebral neonatal en ratones P6: Después del parto el día 6 (P6) de los ratones se anestesian con enfriamiento indirecto en el hielo hasta el punto de falta de respuesta a estímulos dolorosos (anestesia profunda). Después de limpiar la piel con alcohol, una incisión en la línea media ventral se hace en la parte anterior del cuello. Bajo un microscopio de disección, la bifurcación de la arteria carótida común derecha se acerca suavemente retracción de los músculos omohioideo y esternocleidomastoideo. La fascia alrededor de la vaina carotídea se retira, y la rama interna proximal aislada del nervio vago y cerca ganglios simpáticos con un gancho. La arteria carótida interna se cauteriza con una punta de la cauterización. Después de la cauterización, la incisión se sutura la piel, y el animal se mantiene caliente hasta que esté completamente despierto y luego regresó a la presa. Una hora después de la ligadura, el animal se coloca en una cámara sellada impregnada de nitrógeno hasta un nivel del 6,0% de O 2 se alcanza. El animal se expone a 35 min de hipoxia. Después de la exposición la hipoxia, el ratón se recupera en un cojín de la calefacción (33 ° C) durante 30 minutos y luego se devuelve a la presa. Para la creación de la lesión cerebral a la hipoxia combinada / isquemia y la infección / inflamación, el animal se inyecta por vía intraperitoneal con 0,015 ml de lipopolisacárido (LPS, 1 mg / kg). Cuatro días post-hypoxia/ischemia, los ratones se anestesian con enfriamiento indirecto en el hielo hasta el punto de falta de respuesta a los estímulos nocivos, entonces perfundidos con paraformaldehido 4% de solución salina y después. Los cerebros se retiran y se crioprotegieron. Figura 1. Caracterización de la lesión cerebral en el modelo murino de hipoxia / isquemia con tinción H & E. No hay necrosis focal (flechas) en la sustancia blanca cerebral ipsilateral (A) de la ligadura de la carótida, en comparación con la sustancia blanca cerebral contralateral (B). Necrosis ipsilateral y microinfartos focales se observan en el hipocampo (C) y el tálamo (D) en el cerebro con una lesión cerebral ipsilateral materia blanca. Los resultados representativos y cifras: Modelos de ratón de PVL con hipoxia / isquemia y / o infección / inflamación se logran mediante la ligadura de carótida unilateral seguida por la exposición a la hipoxia y la inyección de LPS. Estamos definiendo los modelos de ratón nuevos modelos adecuados PVL. El examen neuropatológico de las secciones coronal teñidas con hematoxilina y eosina (H & E) a través del cerebro anterior revela toda necrosis focal en la materia blanca central del hemisferio cerebral ipsilateral a la ligadura de la carótida (Fig. 1A), con preservación relativa de las neuronas en la corteza que recubre cerebral en comparación con la sustancia blanca cerebral contralateral (Fig. 1B). En el centro de sustancia blanca necrótico, hay un marcado aumento de la celularidad que consiste en macrófagos y astrocitos reactivos, como es característico de PVL humanos focal. En el contralateral sustancia blanca central, el núcleo oligodendroglial están dispuestos en fascicular, como haces, esta arquitectura es completamente alterada por la necrosis focal en el lado ipsilateral. Es de destacar que también se observa necrosis ipsilateral en el hipocampo (Fig. 1C) y el tálamo (microinfartos focales) (Fig. 1D) en el cerebro con una lesión cerebral ipsilateral materia blanca. PVL humanos tampoco se produce en un aislamiento total de las lesiones que acompañan la materia gris. El sello distintivo de PVL es la relación, aunque no completa, ahorradores de la corteza cerebral que recubre el asunto heridos blanco – una característica que creemos que está presente en nuestros modelos de ratón. Figura 2. Escala de puntuación de 0-5 para la evaluación de lesiones de sustancia blanca por MBP o O1 en modelos de ratón de la leucomalacia periventricular. Nuestros modelos de ratón muestran las características de la FPV, tanto a nivel fenotípico y molecular. Hemos utilizado la detección inmunohistoquímica de la proteína básica de mielina (MBP) o antígeno O1 para evaluar una lesión, han establecido una escala estándar de 0 a 5 de la puntuación de la lesión de sustancia blanca (Fig. 2), y han caracterizado a la patología de la sustancia blanca (Fig. . 3). Más recientemente, un ensayo de no sesgada estereológicos se ha implementado para sustituir a la primera semi-cuantitativos método. Además, para probar los efectos correlativos de la lesión de sustancia blanca en los resultados funcionales, se han realizado pruebas de comportamiento de la función motora. Hemos demostrado que los ratones presentan déficit motor impresionante a la hipoxia siguientes P10-21 / isquemia más LPS en P6. Hemos establecido los criterios de puntuación con una escala de 0-4 para definir la disfunción extremidad contralateral en ratones heridos en P10-21. Por lo general, los ratones normales se pueden corretear de un 30 ° de inclinación (puntuación de 4) y sube a 45 ° de inclinación, sin deslizamiento (puntuación de 3). Los ratones lesionados tienen puntuaciones más bajas en correlación con los grados de lesión de sustancia blanca. Figura 3. Caracterización de lesiones de sustancia blanca por MBP o O1 coloración y la estructura de la mielina por microscopía electrónica (EM). MBP y tinción O1 mostrar la mielina perdida en la sustancia blanca cerebral ipsilateral a la ligadura, en comparación con la sustancia blanca contralateral. Examen EM muestra axones mielinizados en la sustancia blanca cerebral contralateral a la ligadura y el tejido degenerado en la materia blanca ipsilateral. Anticipamos que el establecimiento de los modelos de ratón de nuevo PVL nos permitirá estudiar los mecanismos específicos de PVL-como la lesión del cerebro inmaduro. Nos ocuparemos de la patogénesis utilizando cepas de ratones transgénicos para examinar el papel de las moléculas individuales de interés y evaluar los objetivos de la neuroprotección.