Double Recordings somatiques de la gonadolibérine (GnRH) neurones identifiés par Green Fluorescent Protein (GFP) en tranches hypothalamiques

Tranches de cerveau hypothalamique sont préparés, incubé et transféré à la chambre d'enregistrement comme précédemment détaillées (9) chez les animaux dont les neurones expriment la GnRH protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle du promoteur du peptide GnRH (10). Après l'élimination du cerveau de l'animal, le cerveau est bloquée à l'aide d'une lame de rasoir pour éliminer les régions qui ne sont pas d'intérêt. Afin de déterminer les régions de supprimer, le cerveau est placé sur la surface dorsale de sorte que l'hypothalamus peut être visualisée. Pour les deux orientations tranche coronale et sagittale, le cervelet est enlevé. Pour préparation de tranches coronales, la partie rostrale du cortex est enlevé. Dans cette orientation tranche, les régions latérales du cortex fournir un soutien pour le tranchage du cerveau et de fournir suffisamment d'espace de cerveau pour le placement des fils d'argent pour sécuriser le cerveau dans la chambre d'enregistrement. Pour la préparation coupe sagittale, les régions latérales du cerveau sont enlevés et les portions rostrales du cortex fournir le soutien pour le cerveau de tranchage et de placement des fils d'argent pour sécuriser le cerveau à l'enregistrement bien. Tout au long de la procédure de blocage, le cerveau est constamment humidifié par le froid liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) à l'aide d'une pipette en verre. Une petite quantité de superglue est placé sur la plate-forme de coupe. Le cerveau est soulevé avec une spatule. L'excès est éliminé par l'ACSF apporter une Kimwipe à la surface de la spatule et le dessin ACSF excès loin du cerveau. Le cerveau est doucement glissé vers l'avant sur la colle. Il est important de ne pas toucher le cerveau ou le pousser vers le bas sur elle afin de la sécuriser. Le poids du cerveau lui-même est généralement suffisant pour s'assurer qu'il est sécuritaire. Le cerveau et la plate-forme de coupe est alors fixé à la microtome vibrant et la coupe est bien remplie avec le froid ACSF. La solution à froid à la fois le cerveau et les entreprises peuvent protéger contre les dommages causés lors de la procédure de découpe. Différentes régions du cerveau varient selon le degré de froideur qui optimise la qualité des tranches. La température de l'ACSF pour la préparation des tranches hypothalamiques est généralement de 0 ° C. Tranches doit être coupé lentement et chaque tranche devrait flotter librement loin du cerveau. Si les tranches commencent à se courber pendant la coupe, la vitesse à laquelle la lame est la promotion devrait être ralenti. On peut utiliser un petit pinceau à des tranches de déplier, mais cela ne risque d'endommager les tranches et donc, devrait être évitée. Lentement, la vitesse d'avance de la lame est préférée à l'aide d'un pinceau. Comme chaque tranche est coupée par le cerveau, il est retiré de la chambre de coupe et placé dans une chambre d'incubation tranche dans un bain d'eau tiède (environ 32 ° C). L'incubateur tranche est alimenté en continu avec de l'oxygène en utilisant un mélange de 95% d'O 2 et 5% de CO 2. Généralement, le pré-enregistrement d'incubation varie tranche de 30 minutes à 2 heures. Pipettes en verre (3-6 MQ) sont fabriquées comme décrit précédemment (9) en utilisant un extracteur vertical. La température et la durée de tirant varie en fonction du type de pipette extracteur on utilise, le type de verre, on utilise et de la durée de vie du filament de chauffage de l'extracteur. La forme de la pointe de la pipette peut aussi varier selon les préférences de l'utilisateur. Nous avons obtenu de bons résultats avec une pointe effilée de manière uniforme avec une ouverture de 0,1 mm. Des ouvertures plus grandes dans la pipette ont tendance à endommager les neurones alors que les petites ouvertures n'aboutissent pas à des enregistrements de longue durée. Pipettes enduits de Sylgard de réduire la capacité. Embouts de pipette sont tiré légèrement enduit d'Sylgard 184 secondes avec une pipette. Conseils Sylgarded sont ensuite durcis en utilisant la chaleur d'un pistolet thermique. Ces pipettes sont ensuite remplies avec le perfusat bain. Pour augmenter la visualisation des embouts de pipette, une petite quantité d'Alexa-568 est ajoutée à la portion de la solution de bain pour être utilisé comme la solution la pipette avant de remplir les pipettes. Nous ne pèsent pas l'Alexa-568, mais plutôt l'utilisation suffit de tourner le rose solution en vue. Les embouts de pipette peuvent ensuite être visualisées sous le filtre rouge Texas. Nous avons développé une approche pour obtenir des enregistrements de courant pince pour la détection des potentiels d'action en utilisant des joints à faible résistance (voir discussion). Les enregistrements sont effectués à endogènes de la cellule potentiel de repos avec Axoclamp 2B pas appliquée actuel Instrument Axon aide de. Toutefois, en raison de l'étanchéité à faible résistance, on ne pouvait pas détecter les potentiels d'action avec juste l'amplificateur 2B. Pour augmenter le signal, un second amplificateur (AM Systems 3000) est utilisé en série avec le 2B Axoclamp. Cette approche a de la facilité de joints lâches et l'utilité des enregistrements à long terme. Techniquement, on peut mesurer directement les potentiels d'action, contournant ainsi les problèmes liés à l'approche dans le mode d'enregistrement voltage-clamp (voir discussion). On prend deux pipettes à la surface des deux neurones préalablement sélectionné dans le même temps, d'une façon similaire à l'approche de la configuration de l'enregistrement de cellules entières. En approchant les deux neurons dans le même temps a été plus réussi à obtenir les enregistrements doubles que de tenter chaque neurone de la paire de manière indépendante. Pendant ce temps, les impulsions d'injection de courant sont transmis de l'amplificateur 2B comme cela est fait lors de l'approche des cellules entières d'enregistrements. Une pression positive doit être maintenue sur les deux pipettes pour éviter le colmatage de la pointe. Une pression positive pour les enregistrements doubles est le meilleur produit en utilisant une seringue de 3 ml vacants vide attaché à la porte-pipette par une longueur de morceau de tuyau. Utiliser des seringues permet de maintenir la pression sur les deux pipettes. Une pression positive doit être appliqué dès que la pipette a été placé dans la solution du bain de la chambre d'enregistrement. Une des approches les neurones sélectionnés avec les pipettes de manière séquentielle. Après le positionnement de la première pipette directement sur la plus grande surface du neurone, on maintient positifs en laissant la seringue en place et laisse la pipette dans cette position. On retourne alors à la partie supérieure de la chambre d'enregistrement et abaisse la pipette deuxième enregistrement en position. Neurones sont souvent choisis à différents niveaux de la tranche. La première pipette devrait être positionné sur le neurone qui est le plus profond dans la tranche et la position de la pipette deuxième neurone plus superficielles. Cela empêche le positionnement de la pipette seconde de se déplacer le positionnement de la pipette seconde que la tranche se déplace légèrement dans le plan vertical que les pipettes entrer dans la tranche. Joints lâches (18-30 MQ) sera utilisé. La pression positive va induire une petite fossette sur la surface de chaque cellule. Une tentative de sceller le premier neurone en libérant la pression positive et l'application très légère pression négative. La pression positive est libéré en retirant la seringue. Aspiration par la bouche est alors appliquée à l'extrémité libre de la tubulure. Un neurone membrane saine sera de répondre rapidement à la libération de pression positive et adhèrent à la pipette. Légère aspiration va former un joint avec une résistance appropriée dans un neurone sain. Lorsque l'on tente de sceller un neurone et échoue, la pipette ne peut pas être ré-utilisé depuis des membranes d'étanchéité à seulement très propre verre. Au lieu de cela, on élève la pipette (et un objectif de microscope) loin de la surface de la tranche au sommet de la perfusion ainsi, élimine la pipette du bain, des modifications à une pipette propre, puis revient à la tranche d'essayer de sceller une autre cellule . Pour ces raisons, il est important de sélectionner plusieurs neurones potentiels pour les enregistrements. Pour les tranches de 4-6 avec moins de neurones qualité de l'enregistrement à partir de laquelle choisir, la réussite dans l'obtention des enregistrements doubles est limité. Après l'établissement d'un joint lâche basée sur la résistance, les impulsions d'injection de courant issu de l'amplificateur 2B sont terminées. L'amplificateur 2B est placée en série avec l'amplificateur de la série 3000. Dans cette configuration, la sortie de l'amplificateur 2B sert d'entrée pour l'amplificateur de la série 3000. L'amplificateur de signal pour ce dernier fournit d'acquisition de données. Le sceau (étape 4) et la reconfiguration de amplifers (étape 5) est ensuite répété pour la deuxième neurone. Figure 1. Une période de mise à feu a augmenté dans deux neurones à GnRH en utilisant la configuration d'enregistrement joint lâches attachées dans une préparation coupe sagittale. La tranche a été dérivé à partir d'un mâle castré. Chaque flèche vers le haut indique un potentiel d'action. Notez qu'un neurone GnRH (traces en haut) montre tir presque continu tandis que le second neurone GnRH expositions rafales intermittentes. Ce modèle d'activité de neurones à GnRH seule est similaire à celui des unités simples extraits de plusieurs unités d'enregistrements pendant la sécrétion d'hormone in vivo (7). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 1.