視床下部スライスに緑色蛍光タンパク質（GFP）によって識別されるゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）ニューロンから二重の体細胞の録音

視床下部の脳切片を調製し、インキュベートし、GnRHニューロンのGnRHペプチドのプロモーター（10）の制御下に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現動物で（9）以前に詳細な記録室に転送されます。動物からの脳を除去した後、脳は関心のない地域をなくすためにカミソリの刃を使用してブロックされます。視床下部は、可視化できるよう、削除する領域を決定するために、脳はその背面に配置されます。冠状および矢状スライスの方向の両方に、小脳は削除されます。冠状スライス標本の場合は、皮質の吻側部分が削除されます。このスライスの向きで、皮質の外側の領域は、脳をスライスするためのサポートを提供し、録音室内の脳を保護するために銀線を配置するための脳の十分な領域を提供しています。矢状スライスの準備に、脳の外側の領域を除去し、皮質の吻側部分は、スライス脳のためともレコーディングで脳を保護するために銀線の配置のためのサポートを提供している。ブロッキングの手順では、脳が継続的にガラスピペットを用いてコールド人工脳脊髄液（ACSF）で湿らせている。 スーパー接着剤に少量の最先端のプラットフォーム上に配置されます。脳は、スパチュラで解除されます。過剰ACSFは、ヘラの表面にキムワイプを持参し、脳から過剰なACSFを描画することによって除去される。脳を穏やかに接着剤の上に前方にスライドさせる。それを確保するために脳に触れたり、その上にプッシュダウンしないすることが重要です。脳自体の重量は、通常、それが安全であることを確認するのに十分です。 脳と最先端プラットフォームは、振動ミクロトームに固定され、切断はよく風邪ACSFで満たされている。冷溶液には、両方の企業の脳を、切削作業中に損傷から保護するかもしれない。異なる脳の領域は、品質のスライスを最適化する寒さの度合いが異なります。視床下部スライスの調製のためのACSFの温度は、通常0℃です。 スライスは徐々にカットする必要があり、各スライスは脳から離れて自由にフロートしてください。スライスは、切削時のカールを開始する場合、ブレードが進んでいる速度が遅くなることがあります。一つは、スライスを真っすぐにするために、小さなペイントブラシを使用することができますが、これはスライスのリスクを傷めるおそれがないので、避けるべきである。ゆっくりとブレードの事前の速度は、ペイントブラシを使用してより優先されます。 各スライスは脳から切断されると、それはカッティングチャンバから引き出され、温水浴（約32℃）でのスライスのインキュベーションチャンバー内に配置されます。スライスインキュベーターは、連続して95％O 2および5％CO 2の混合物を用いて酸素が ​​供給されている。一般に、プリレコーディングスライスのインキュベーションは、30分から2時間の範囲である。 前述のようにガラスピペット（MΩ3-6）垂直プーラーを使用して（9）製造される。引っ張りの温度と持続時間は、ピペットプラー目のものの種類、ガラスのいずれかを入力使用と引き手の加熱フィラメントの寿命に基づいて異なります。ピペットの先端の形状はまた、ユーザの好みによって異なります。我々は、0.1 mmの開口部を均一にテーパ状の先端との良好な成功を達成している。ピペットの大きな開口部が小さい開口部は、長時間録音につながることに失敗しながら神経細胞を損傷する傾向がある。 ピペットは、静電容量を減らすためにSylgardでコーティング。プルピペットチップは軽くSylgard 184は第二ピペットを使用してでコーティングされています。 Sylgardedのヒントは、ヒートガンを使用して熱硬化しています。これらのピペットは、バスの灌流液で満たされている。ピペットチップの可視化を向上させるために、アレクサ- 568少量のピペットを充填する前に、ピペット溶液として使用する浴溶液の部分に追加されます。我々はAlexa – 568の重量を量るのではなく、目でソリューションのピンクをオンにするのに十分使用しないでください。ピペットチップは、テキサスレッドフィルターで可視化することができる。 我々は、低抵抗のシールを（説明を参照）を使用して活動電位の検出のための現在のクランプ記録を取得するためのアプローチを開発しました。録音はない適用される現在使用して軸索のインストゥルメントの2B Axoclampと細胞の内因性の静止電位で実行されます。しかしながら、低抵抗のシールに、一つだけ2Bアンプで活動電位を検出できませんでした。信号を高めるために、第2増幅器（AMシステムズ3000）Axoclampの2Bと直列に使用されています。このアプローチは、長期的な録音の緩いシールとユーティリティの使いやすさを持っています。技術的に、人は直接それによって電圧クランプ記録モード（説明を参照）のアプローチで問題を回避して、活動電位を測定することができます。 一つは、全細胞記録設定のためのアプローチとして、同様の方法で、同時に二つの以前に選択されたニューロンの表面に2つのピペットを取ります。両方のNEへのアプローチ同時にuronsは独立してペアのそれぞれのニューロンを試みるよりもデュアル録音を得ることに成功している。細胞全体の記録のためのアプローチの間に行われているようにこの時間の間に、電流注入パルスが2Bアンプから渡されます。 正圧は、先端の目詰まりを防ぐために両方のピペットで維持する必要があります。デュアル録音のための肯定的な圧力は、最高のチューブの部分の長さによってピペットホルダーに取り付けられた充填されていない3ミリリットル空のシリンジを使用して生成されます。注射器を使用することで、1つは、両方のピペットへの圧力を維持することができます。正圧は、すぐにピペットが録音室の浴溶液に配置されているように適用する必要があります。一つは、順番にピペットで選択されたニューロンに近づく。ニューロンの最大の表面上に直接最初のピペットを配置した後、一つの場所に注射器を残すことによって正の保持して、この位置でピペットを残します。一つは、録音室の上部に戻り、位置に第2の記録ピペットを低下させる。選択されたニューロンは、スライスの異なるレベルで、しばしばです。第一ピペットは、スライスと位置で、より表面的なニューロンの第二ピペット深いですニューロンを介して配置する必要があります。これは、ピペットはスライスを入力すると、スライスは垂直面で若干移動するように、第2ピペットの位置をシフトから二番目ピペットの位置を防ぎます。 ルースシール（MΩ18〜30）が使用されます。正圧は、それぞれの細胞の表面に小さなくぼみが誘発される。一つは、正圧を解放し、非常にわずかな負圧を印加して、最初のニューロンを封印しようとします。正圧は、注射器を除去することによって解除されます。口による吸引は、チューブの自由端に適用されます。健康的なニューロンの膜は、すぐに正圧のリリースに対応し、ピペットを遵守します。わずかな吸引は、健康な神経細胞の適切な抵抗を持つシールを形成します。 膜は非常にきれいなガラスにシール以来一ニューロンと障害が発生した場合を封印しようとすると、ピペットは再使用できません。その代わりに、人はよく灌流の上に離れてスライスの表面からピペットを（と顕微鏡対物）が発生、バスからピペットを削除する、クリーンなピペットに変更し、別のセルを封止するために試みるようにスライスして返します。 。これらの理由から、それは録音のための複数の潜在的な神経細胞を選択することが重要です。選択可能な以下の4月6日録音品質のニューロンとスライスの場合は、デュアル録音を得るための成功は限られている。 抵抗に基づいて、緩いシールを確立した後、2Bアンプからの電流注入パルスが終端されます。 2Bのampliferは、3000シリーズのampliferと直列に配置されています。この構成では、2Bのampliferの出力は、3000シリーズのampliferのための入力として機能します。後者ampliferは、データ取得のための信号を提供します。 シール（ステップ4）とamplifersの再構成（ステップ5）、2番目のニューロンごとに繰り返されます。 図1の期間は、矢状スライス標本で緩いシール添付の録画設定を使用して、2つのGnRHニューロンの発火を増加した。スライスは、去勢された男性から派生した。それぞれ上向きたわみは活動電位を示している。第二のGnRHニューロンは、断続的なバーストを示す、一方のGnRHのニューロン（上部トレース）がほぼ連続的な発火を示すことに注意してください。単一のGnRHニューロンからの活動のこのパターンは、 生体内でホルモンの分泌（7）中に、マルチユニット記録から抽出された単一のユニットのものと似ています。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。