Двойной Записи Соматические от гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ) Нейроны, идентифицируемый зеленый флуоресцентный белок (GFP) в гипоталамус Ломтики
Summary
Деятельность в нейронных систем часто требует синхронной потенциала действия разрядов от нейронов в конкретной группе населения. Например, бобовые гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ), вероятно, потребует скоординированных действий между ГнРГ нейронов. Мы представляем наш методологический подход к получению надежного одновременного электрофизиологических записей с диффузно распределенных ГнРГ нейронов.
Abstract
Гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ) представляет собой небольшой нейропептида, который регулирует гипофиз релизе лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Эти гонадотропинов имеют важное значение для регуляции репродуктивной функции. GnRH-содержащие нейроны распределяются диффузно по всему гипоталамус и проект срединного возвышения, где они выпускают ГнРГ от своих терминалов аксона в hypophysiotropic портальной системе (1). В портала капилляров, GnRH едет в передней доли гипофиза, чтобы стимулировать высвобождение гонадотропинов в системный кровоток. GnRH релиз не является непрерывным, а происходит в эпизодических импульсов. Хорошо известно, что прерывистый способ ГнРГ релиз имеет важное значение для воспроизводства (2, 3).
Координация деятельности нескольких нейронов ГнРГ, вероятно, лежит в основе импульсов ГнРГ. Общее содержание пептида в ГнРГ нейронов составляет приблизительно 1,0 пг / клетка (4), из которых 30% вероятно, включает в себя разборных бассейн. Уровни ГнРГ во время импульса (5, 6), предлагаю несколько ГнРГ нейронов, вероятно, участвует в нейросекреции. Кроме того, одна единица активности, извлеченные из гипоталамуса многоквартирных записи во время LH релизе указывает изменения в деятельности нескольких нейронов (7). Электроды с записанными активность во время импульсов ЛГ связаны либо с ГнРГ somata или волокон (8). Поэтому, по крайней мере часть этой деятельности возникает из-ГнРГ нейронов.
Механизмы, которые приводят к синхронизированной стрельбы в нейронах гипоталамуса ГнРГ неизвестны. Выяснению механизмов, которые координируют стрельбы в ГнРГ нейронов представляет собой сложную проблему. Во-первых, ГнРГ нейронов относительно мало. У грызунов, Есть 800-2500 ГнРГ нейронов. Пока не ясно, что все ГнРГ нейронов участвуют в эпизодических релиз ГнРГ. Более того, ГнРГ нейронов диффузно распределенные (1). Это усложнило наше понимание координации стрельбы и сделал много технических подходов неразрешимыми. Мы оптимизировали свободные ячейки подключением записей в текущем режиме зажим для прямого выявления потенциалов действия и развитых записи подход, который позволяет одновременно записи из пар ГнРГ нейронов.
Protocol
Discussion
Деятельности, представляющей интерес в некоторых нейронов в том числе ГнРГ нейронов (основано на секрецию гормонов) происходит на временных масштабах часов (5-7). Таким образом, вся конфигурация ячейки не лучший выбор для некоторых экспериментальных целей из-за диализ внутриклеточных мессенджеров в целом режим записи клетки. Во вторую очередь, цельноклеточная записи, как правило, ограничивается животных меньше, чем о 120-дневного возраста. С возрастом появляются нейрональных мембран напрягаться, делая высокой печати сопротивления трудно достичь. Кроме того, если один получает высокую печать сопротивление, разрывая патч нарушает печать, оставляя отверстие между пипеткой и мембраны. Это приводит к непригодным для использования записи и нейрона, который позволяет быстро умирают из-за ионного дисбаланса. Регулярные циклы яичников, и, таким образом, стабильная деятельность ГнРГ генератора импульсов происходит только в более позднем возрасте (7-10 месяцев в C57Bl6 самок, 11, 12), вне возраста, когда можно обоснованно ожидать получения цельноклеточная записей надежно. Наконец, цельноклеточная записей уничтожить эндогенных соотношения внутренних и внешних концентраций ионов. В целом записи клетки, внутренней концентрации любого иона равна концентрации ионов в пипетку раствор. Это потому, что решение пипетки сравнительно большой объем быстро достигает равновесия с / заменяет относительно небольшой объем эндогенные клетки.
Свободные ячейки прилагается подход позволяет обойти многие ограничения цельноклеточная записей. Во-первых, низкая печать сопротивления (15-30 МОм) могут быть использованы. Они относительно легко даже в форме нейронов с более старых животных. Во-вторых, никто не разрыв запечатанных участок мембраны. Таким образом, свободная клетка прилагается записей технически гораздо проще, чем цельноклеточная записей. Кроме того, так как клеточная мембрана не повреждена, диализ внутриклеточных компонентов не происходит, и эндогенные ионных отношения сохраняются. Нельзя использовать свободные ячейки прилагается подход к изучению синаптические токи, но он идеально подходит для долгосрочной записи из нейронов в относительно неинвазивным способом. Клеточного прилагается записи могут также быть выполнены с использованием любого стандартного внутриклеточного раствора в пипетку. Это дает дополнительное преимущество разрывом мембраны патч, когда продолжительной записи срок завершения и маркировки нейрон с внутриклеточных маркер.
Свободные ячейки прилагается подход был использован в напряжении зажим режиме записи. Тем не менее, напряжение-зажим записи в свободные ячейки прилагается конфигурация имеет ряд методологических проблем. Во-первых, записанный сигнал косвенным показателем активности. Сигнал, который измеряется (как так называемые действия тока) емкостной ток, который заряжает мембрану (13). Это чрезвычайно важный методологический вопрос. Емкость и сопротивление записи пипетки может фильтровать записанного сигнала. Очень вероятно, что малые токи действия теряются в зарядке емкость пипетки, которая, не может быть должным образом компенсирован у большинства усилителей, из-за высокой устойчивости headstage. Когда эти сигналы остаются незамеченными, очевидно шаблон стрельбы нейрона не отражает истинной картины стрельбы. Кроме того, некомпенсированные пипетки и печатью сопротивления привести к значительным ошибкам в измерениях во время изменения, такие, как тогда, когда токи действия выражаются (13). Некоторые усилители обеспечивают емкость и сопротивление "компенсации" за пипетку и печатью, что ограничивает потери сигнала, но и высокой устойчивостью голову стадиях большинство усилителей препятствует оптимальной компенсации. Во-вторых, искусственная ситуация накладывается на ячейку. В напряжения зажим режим, область вокруг клеточных мембран проводится для фиксированного потенциала, в этих исследованиях, 0 мВ. Это не означает, в настоящее время нет применительно к клеточной мембране. Сигнал измеряется в вольт-зажим на самом деле количество тока применяются к мембраны для поддержания фиксированного потенциала. Таким образом, это касалось ток может изменять активность клеток.
Двойной записи в ГнРГ системы особенно сложно из-за ограниченного числа ГнРГ нейронов и их диффузное распределение. Для двойной записи, чтобы быть успешным, манипулятор должна быть чрезвычайно стабильна. Даже незначительные движения электрода может вызвать пипетку соскользнуть нейрона и окончания записи. Более того, движение пипетки на ячейку (например, повторное позиционирование для компенсации движения) может изменить стрельбы узоры. Некоторые ионные каналы, такие N-типа кальциевых каналов механически чувствительных: мембранные растянуть причины повторяющихся деятельности как целых клеток и клеточных прилагаются записи конфигурации (14). Наконец, манипулятор система должна быть способна чрезвычайно тонкой и плавного движения. Как отмечалось выше, с двумя записями, одна принимает два пипетки на поверхность двух ранее выбранных нейронов в то же время и пытается печатьодин нейрон. В случае успеха, то попытки, чтобы запечатать второй ячейке. Вообще, нельзя ожидать, чтобы запечатать и имеют высокое качество записи с каждой попыткой. Это, однако, создает особую проблему с двойной записи. Если кто-то успешно с первого нейрона, но не со второго, надо менять пипетки и попробуйте другой ячейке. Таким образом, надо уметь передвигаться как погружение цель микроскопа и пипеткой в начало перфузии также (чтобы изменить пипетки), не нарушая успешно запечатанных нейрона.
Наши разработки и использования свободной ячейки подключением подход к двойной записи является значительным техническим достижением в изучении ГнРГ нейронов. Это, вероятно, принести полезные результаты, которые помогут двигаться вперед поле в контексте критических вопрос о том, какие механизмы лежат в основе скоординированной деятельности, что приводит к пульсирующей секреции гормона.
Acknowledgements
Я благодарен Рональд Л. Калабрезе, Дитер Jaeger (Университет Эмори) и Уорд Юхас (Axon Instruments) за полезные обсуждения технических вопросов.
References
- Silverman, A. J., Knobil, E., Neill, J. D. The gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neuronal systems: immunocytochemistry. The Physiology of Reproduction. , (1994).
- Freeman, M. E., Knobil, E., Neill, J. D. The neuroendocrine control of the ovarian cycle of the rat. In: The physiology of reproduction. The Physiology of Reproduction. , (1994).
- Belchetz, P. E., Plant, T. M., Nakai, Y., Keogh, E. J., Knobil, E. Hypophysial responses to continuous and intermittent delivery of hypopthalamic gonadotropin-releasing hormone. Science. 202, 631-633 (1978).
- Maurer, J. A., Wray, S. Luteinizing hormone-releasing hormone quantified in tissues and slice explant cultures of postnatal rat hypothalami. Endocrinology. 140, 791-799 (1999).
- Harris, G. C., Levine, J. E. Pubertal acceleration of pulsatile gonadotropin-releasing hormone release in male rats as revealed by microdialysis. Endocrinology. 14, 163-171 (2003).
- Sisk, C. L., Richardson, H. N., Chappell, P. E., Levine, J. E. In vivo gonadotropin-releasing hormone secretion in female rats during peripubertal development and on proestrus. Endocrinology. 142, 2929-2936 (2001).
- Cardenas, H., Ordog, T., O’Byrne, K. T., Knobil, E. Single unit components of the hypothalamic multiunit electrical activity associated with the central signal generator that directs the pulsatile secretion of gonadotropic hormones. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 9630-9634 (1993).
- Silverman, A. J., Wilson, R., Kesner, J. S., Knobil, E. Hypothalamic localization of multiunit electrical activity associated with pulsatile LH release in the rhesus monkey. Neuroendocrinology. 44, 168-171 (1986).
- Roberts, C. B., O’Boyle, M. P., Suter, K. J. Dendrites determine the contribution of after depolarization potentials (ADPs) to generation of repetitive action potentials in hypothalamic gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neurons. J Comput Neurosci. 26, 39-53 (2009).
- Spergel, D. J., Kruth, U., Hanley, D. F., Sprengel, R., Seeburg, P. H. GABA- and glutamate-activated channels in green fluorescent protein-tagged gonadotropin-releasing hormone neurons in transgenic mice. J Neurosci. 19, 2037-2050 (1999).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol Reprod. 27, 327-339 (1982).
- Gee, D. M., Flurkey, K., Finch, C. E. Aging and the regulation of luteinizing hormone in C57BL/6J mice: impaired elevations after ovariectomy and spontaneous elevations at advanced ages. Biol Reprod. 28, 598-607 (1983).
- Anson, B. D., Roberts, W. M., Walz, W., Boulton, A. A., Baker, G. B. Loose-patch voltage-clamp technique. Neuromethods, Patch-clamp analysis: Advanced techniques. 35, 265-286 (2002).
- Calabrese, B., Tabarean, T., Juranka, P., Morris, C. E. Mechanosensitivity of N-type calcium channel currents. Biophys J. 83, 2560-2574 (2002).
- Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. Rapid killing of single neurons by irradiation of intracellularly injected dye. Science. 206, 702-704 (1979).
- Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice. J Physiol. 550, 159-167 (2003).
