Las grabaciones de doble somáticas de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) identificados por la proteína verde fluorescente (GFP) en cortes de hipotálamo

Rebanadas hipotálamo del cerebro se preparan, se incuban y se transfiere a la cámara de grabación como se ha detallado anteriormente (9) en los animales, cuyas neuronas GnRH expresan la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control del promotor del péptido GnRH (10). Después de la extracción del cerebro del animal, el cerebro se bloquea con una cuchilla de afeitar para eliminar las zonas que no son de su interés. Con el fin de determinar las regiones a eliminar, el cerebro se coloca en la superficie dorsal de manera que el hipotálamo puede ser visualizada. Por tanto las orientaciones corte coronal y sagital, el cerebelo se ha eliminado. Para la preparación corte coronal, la porción rostral de la corteza se extrae. En esta orientación rebanada, la región lateral de la corteza proporcionan apoyo para cortar el cerebro y proporcionar suficiente área del cerebro para la colocación de alambres de plata para asegurar que el cerebro en la cámara de grabación. Para la preparación corte sagital, las regiones laterales del cerebro se eliminan y la parte rostral de la corteza proporcionan el apoyo para el cerebro de corte y la colocación de alambres de plata para asegurar que el cerebro en la grabación también. A lo largo del procedimiento de bloqueo, el cerebro está continuamente humedecido con el líquido frío artificial cefalorraquídeo (ACSF) utilizando una pipeta de vidrio. Una pequeña cantidad de pegamento se coloca en la plataforma de corte. El cerebro se levanta con una espátula. El exceso de ACSF se elimina por traer un Kimwipe a la superficie de la espátula y el dibujo ACSF sobrante del cerebro. El cerebro es suavemente se deslizó hacia delante en la cola. Es importante no tocar el cerebro o el empuje hacia abajo en él con el fin de asegurarla. El peso del cerebro en sí es suficiente para garantizar su seguridad. El cerebro y la plataforma de corte entonces se asegura que el microtomo vibración y el corte y se llena de frío ACSF. La solución fría de ambas empresas en el cerebro y puede proteger de posibles daños durante el procedimiento de corte. Diferentes regiones del cerebro varían en el grado de frialdad que optimiza la calidad de las rebanadas. La temperatura de la ACSF para la preparación de cortes hipotálamo es generalmente de 0 ° C. Lonchas deben ser cortadas y poco a poco cada corte debe flotar libremente fuera del cerebro. Si los segmentos empiezan a curvarse durante el corte, la velocidad a la que la hoja se debe avanzar más lento. Se puede utilizar un pincel pequeño para desenroscar rodajas, pero esto es el riesgo de dañar los cortes y por lo tanto, debe ser evitado. Poco a poco la velocidad de avance de la hoja es preferible utilizar un pincel. Como cada rodaja se corta en el cerebro, se retira de la cámara de corte y se coloca en una cámara de incubación de división en un baño de agua caliente (a unos 32 ° C). La porción de la incubadora es un suministro continuo de oxígeno, usando una mezcla de 95% O 2 y el 5% de CO 2. En general, el registro de pre-incubación oscila corte de 30 minutos a 2 horas. Pipetas de vidrio (3.6 MW) se fabrican como se describió previamente (9) con un extractor vertical. La temperatura y la duración de tirar varía en función del tipo de pipeta extractor se utiliza, el tipo de vidrio se utiliza y la vida útil del filamento de calentamiento del tirador. La forma de la punta de la pipeta también puede variar dependiendo de la preferencia del usuario. Hemos logrado buenos resultados con una punta afilada de manera uniforme con una abertura de 0,1 mm. Aberturas más grandes en la pipeta tienden a dañar las neuronas mientras que las pequeñas aberturas no culminan en grabaciones de larga duración. Pipetas recubiertos con Sylgard para reducir la capacidad. Sacó punta de la pipeta se ha cubierto ligeramente con Sylgard 184 con una pipeta segundos. Consejos Sylgarded son entonces curado con calor con una pistola de calor. Estas pipetas se llenan con la perfusión de baño. Para aumentar la visualización de la punta de la pipeta, una pequeña cantidad de Alexa-568 se añade a la parte de la solución del baño para ser usado como la solución de la pipeta antes de llenar las pipetas. No pesan los Alexa-568, sino más bien el uso suficiente para cambiar el color de rosa solución a simple vista. La punta de la pipeta puede ser visualizado en el filtro de Texas rojo. Hemos desarrollado un método para obtener corriente-clamp grabaciones para la detección de potenciales de acción con los sellos de baja resistencia (ver Discusión). Las grabaciones se realizaron en el potencial endógeno de reposo de la célula con Axoclamp 2B no aplica actual Instrumento con Axon. Sin embargo, debido al sello de baja resistencia, no se podía detectar los potenciales de acción con un solo amplificador 2B. Para aumentar la señal, un amplificador de segunda (AM Sistemas de 3000) se utiliza en la serie con el 2B Axoclamp. Este enfoque tiene la facilidad de sellos sueltos y la utilidad de registros a largo plazo. Técnicamente, se puede medir directamente los potenciales de acción, que permite eludir los problemas con el enfoque en el modo de grabación de voltaje-clamp (ver Discusión). Se toma dos pipetas de la superficie de las dos neuronas previamente seleccionados, al mismo tiempo, de una manera similar como el enfoque para la configuración de la celda grabación completa. Acercarse a los neurons al mismo tiempo, ha tenido más éxito en la obtención de las grabaciones de dos de tratar cada neurona de la pareja de forma independiente. Durante este tiempo, pulsos de corriente de inyección se pasan desde el amplificador 2B como se hace durante la aproximación para el conjunto de células grabaciones. La presión positiva se debe mantener en los dos pipetas para evitar la obstrucción de la punta. Presión positiva para las grabaciones de dos es el mejor generada mediante el uso de una jeringa de 3 ml sin llenar vacíos adjunta al titular de la pipeta por una longitud de la pieza de la tubería. Con jeringas permite mantener la presión en ambos pipetas. La presión positiva se debe aplicar tan pronto como la pipeta se ha colocado en la solución del baño de la cámara de grabación. Uno se acerca a las neuronas seleccionadas con las pipetas de forma secuencial. Después de colocar la primera pipeta directamente sobre la mayor superficie de la neurona, uno mantiene positiva, dejando la jeringa en su lugar y sale de la pipeta en esta posición. Uno vuelve a la parte superior de la cámara de registro y disminuye la pipeta segunda grabación en su posición. Neuronas seleccionadas están a menudo en los diferentes niveles de la división. La primera pipeta debe ser colocado sobre la neurona que es la más profunda en el corte y la posición de la pipeta segundo en la neurona más superficial. Esto evita que el posicionamiento de la pipeta segundo de cambiar el posicionamiento de la pipeta segundo que la división se moverá ligeramente en el plano vertical como pipetas entrar en el sector. Sellos sueltos (18-30 MW) se utilizará. La presión positiva se induce un pequeño hoyuelo en la superficie de cada célula. Uno los intentos de cerrar la primera neurona por la liberación de presión positiva y la aplicación de presión negativa muy leve. La presión positiva se libera mediante la eliminación de la jeringa. De succión con la boca se aplica al extremo libre de la tubería. La membrana de una neurona sana responderá rápidamente a la liberación de presión positiva y se adhieran a la pipeta. Ligera succión se forma un sello con la resistencia adecuada en una neurona sana. Cuando uno intenta sellar una neurona y no, la pipeta no se puede volver a utilizar ya que las membranas sólo sello muy limpio de vidrio. En cambio, eleva la pipeta (y objetivo de microscopio) de distancia de la superficie de la porción de la parte superior de la perfusión, así, elimina la pipeta del baño, los cambios en una pipeta limpia y luego regresa a la corte para tratar de sellar otra célula . Por estas razones, es importante seleccionar múltiples neuronas potencial para las grabaciones. Para cortes con menos de 4.6 neuronas calidad de grabación entre los que elegir, el éxito en la obtención de grabaciones de doble es limitado. Después de establecer un sello suelto sobre la base de la resistencia, los pulsos de inyección de corriente del amplificador 2B se terminan. El amplificador 2B se coloca en serie con el amplificador de la serie 3000. En esta configuración, la salida del amplificador 2B sirve como entrada para el amplificador de la serie 3000. El amplificador proporciona una señal de éste para la adquisición de datos. El sello (paso 4) y la reconfiguración de amplifers (paso 5) se repite para la segunda neurona. Figura 1. Un período de aumento de disparar en dos neuronas GnRH con la configuración de grabación del sello suelta adjunta en una preparación de corte sagital. El corte se obtuvo de un macho castrado. Cada flecha hacia arriba indica un potencial de acción. Tenga en cuenta que una neurona GnRH (huellas parte superior) muestra disparando casi continua, mientras que la segunda neurona GnRH presenta ráfagas intermitentes. Este patrón de actividad de las neuronas GnRH solo es similar a la de las unidades individuales extraídos de grabaciones de varias unidades en la secreción de hormonas en vivo (7). Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 1.