المزدوج من تسجيلات الجسدية لإفراز هرمون موجهة الغدد التناسلية (GnRH) الخلايا العصبية التي تم تحديدها بواسطة بروتين الفلورية الخضراء (GFP) في شرائح طائية
Summary
النشاط في النظم العصبية وغالبا ما يتطلب العمل التصريف متزامن المحتملة من الخلايا العصبية داخل مجموعة سكانية محددة. على سبيل المثال ، نبضات موجهة الغدد التناسلية لإفراز هرمون (GnRH) المرجح أن يتطلب تنسيق النشاط بين الخلايا العصبية GnRH. نقدم أسلوبنا المنهجي للحصول على تسجيلات موثوق بها في وقت واحد من الخلايا العصبية الكهربية في GnRH توزيع منتشرة.
Abstract
موجهة الغدد التناسلية لإفراز هرمون (GnRH) هو الذي ينظم neuropeptide صغيرة من هرمون الغدة النخامية الافراج اللوتيني والهرمون المنبه للجريب (FSH). الجونادوتروبين هذه ضرورية لتنظيم وظيفة الإنجاب. وتوزع على الخلايا العصبية التي تحتوي على GnRH منتشرة في جميع أنحاء منطقة ما تحت المهاد والمشاريع البارزة في الوسط حيث يطلقون GnRH من محطات محوار بهم في نظام البوابة نخامي التوجه) 1 (. الشعيرات الدموية في المدخل ، GnRH يسافر إلى الغدة النخامية لتحفيز إطلاق سراح الجونادوتروبين إلى الدوران الجهازي. GnRH الإفراج مستمر ولكن لا يحدث في البقول بدلا العرضية. ومن الثابت أن الطريقة متقطعة من اطلاق سراح GnRH ضروري لاستنساخ (2 ، 3).
تنسيق نشاط الخلايا العصبية GnRH متعددة ربما يكمن وراء GnRH البقول. إجمالي محتوى الببتيد في الخلايا العصبية ما يقرب من 1.0 GnRH الغرام / خلية (4) ، والتي تضم 30 ٪ من المحتمل تجمع نشره. مستويات GnRH خلال نبضة (5 ، 6) ، وتشارك ربما توحي GnRH متعددة في الخلايا العصبية neurosecretion. وبالمثل ، واحد وحدة النشاط المستخرجة من تسجيلات متعددة الوحدات طائي في أثناء فترة الإفراج LH يشير إلى تغييرات في نشاط الخلايا العصبية متعددة (7). وترتبط الأقطاب مع النشاط المسجل خلال نبضات LH إما مع somata GnRH أو الألياف (8). لذلك ، على الأقل بعض من هذا النشاط ينشأ من الخلايا العصبية GnRH.
الآليات التي تؤدي إلى إطلاق متزامنة في الخلايا العصبية GnRH طائي غير معروفة. توضيح آليات تنسيق اطلاق النار في الخلايا العصبية GnRH مشكلة معقدة. أولا ، GnRH الخلايا العصبية هي قليلة نسبيا من حيث العدد. في القوارض ، وهناك 800-2500 GnRH الخلايا العصبية. ليس من الواضح أن تشارك جميع الخلايا العصبية في اطلاق سراح GnRH GnRH العرضية. وعلاوة على ذلك ، يتم توزيع منتشرة GnRH الخلايا العصبية (1). أدى هذا إلى تعقيد فهمنا للتنسيق اطلاق النار ، وجعلت العديد من المناهج الفنية مستعصية على الحل. ونحن فضفاضة الأمثل الخلية المرفقة التسجيلات في وضع المشبك الجاري للكشف عن مباشرة العمل ، وإمكانيات وضع نهج التسجيل التي يسمح للتسجيلات في وقت واحد من أزواج من الخلايا العصبية GnRH.
Protocol
Discussion
نشاط الخلايا العصبية في بعض المصالح بما في ذلك الخلايا العصبية GnRH (استنادا إلى إفراز هرمون) تحدث على فترات زمنية من ساعات (5-7). لذلك ، تكوين خلية كاملة ليست هي الخيار الأفضل لبعض الأهداف التجريبية نظرا لغسيل الكلى من رسل الخلايا في وضع خلية تسجيل بأكملها. ثانوي ، تقتصر عموما خلية كاملة تسجيلات للحيوانات تقل عن 120 يوما من العمر. مع التقدم في العمر ، والأغشية العصبية ويبدو أن تشديد ، مما يجعل من الصعب مقاومة عالية الاختام لتحقيقه. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان أحد يحصل على ختم مقاومة عالية ، وتمزق التصحيح يعطل الختم ، وترك حفرة بين ماصة والأغشية. هذا يؤدي إلى تسجيل غير صالحة للاستعمال والخلايا العصبية التي تموت بسرعة بسبب الاختلالات الأيونية. دورات منتظمة المبيض ، وبالتالي ، والنشاط المستقر للمولد النبض GnRH لا يحدث إلا في وقت لاحق في الحياة (7-10 شهرا من العمر في C57Bl6 الإناث ، 11 ، 12) ، وأبعد من العمر عندما يمكن للمرء أن يتوقع الحصول على نحو معقول كامل الخلية التسجيلات صحيح. أخيرا ، خلية كاملة التسجيلات تدمير الذاتية نسب تركيزات أيون الداخلية والخارجية. مع تسجيلات خلية كاملة ، وتركيز أيون الداخلية لأي يساوي تركيز أيون في حل ماصة. هذا هو الحل لأن ماصة من حيث الحجم الكبير نسبيا تصل بسرعة التوازن مع / يستبدل الحجم الصغير نسبيا الداخلية للخلية.
نهج الخلية فضفاضة يعلق تلتف حول العديد من القيود المفروضة على كامل الخلية التسجيلات. أولا ، يمكن استخدام ختم مقاومة منخفضة (15-30 MΩ). هذه هي سهلة نسبيا لتشكيل الخلايا العصبية حتى في كبار السن من الحيوانات. وثانيا ، فإن المرء لا تمزق غشاء مختومة من التصحيح. ولذلك ، والتسجيلات الخلية فضفاضة المرفقة فنيا أسهل بكثير من خلية كاملة التسجيلات. بالإضافة إلى ذلك ، لأن غشاء الخلية سليمة ، وغسيل الكلى لمكونات الخلايا لا تحدث ، ويتم الحفاظ على نسب الأيونية الذاتية. لا يمكن للمرء استخدام نهج الخلية فضفاضة يعلق لدراسة التيارات متشابك لكنه يعتبر مثاليا لمدة طويلة الأجل من الخلايا العصبية في التسجيلات بطريقة غير الغازية نسبيا. ويمكن أيضا الخلية التسجيلات المرفقة به أن يتم تنفيذ أي حل في مستوى الخلايا الماصة. هذا يوفر ميزة إضافية تتمثل في تمزق غشاء التصحيح عند اكتمال تسجيل المدى الطويل ، ووصفها عصبون مع علامة داخل الخلايا.
وقد استخدم نهج الخلية فضفاضة يعلق في وضع تسجيل الجهد المشبك. ومع ذلك ، الجهد المشبك تسجيل في تكوين الخلية فضفاضة يعلق لديه مشاكل منهجية عديدة. أولا ، الإشارات المسجلة هو مقياس غير مباشر من النشاط. في إشارة إلى أن يقاس (كما يسمى العمل الحالية) هو بالسعة الحالية التي تهم الغشاء (13). هذه مسألة في غاية الأهمية المنهجية. يمكن أن السعة والمقاومة لماصة تسجيل تصفية الإشارات المسجلة. فمن المحتمل جدا أن تضيع تيارات العمل في شحن صغيرة السعة للماصة التي لا يمكن تعويضها بشكل صحيح مع معظم مكبرات الصوت ، وذلك بسبب مقاومة عالية للheadstage. عندما تذهب هذه الاشارات التي لم يتم كشفها ، ونمط واضح لإطلاق الخلايا العصبية لا تعكس نمط اطلاق صحيحا. وبالمثل ، ماصة بدون تعويض والمقاومات ختم تؤدي إلى أخطاء كبيرة في القياسات خلال إجراء تغييرات مثل عندما يتم التعبير عن تيارات العمل (13). بعض مكبرات الصوت توفير السعة والمقاومة "التعويض" للماصة والختم ، مما يحد من فقدان إشارة ، ولكنها مرتفعة مراحل رأس المقاومة لمعظم مكبرات الصوت تعيق التعويض الأمثل. ثانيا ، فرض حالة مصطنعة على الخلية. في الجهد المشبك واسطة ، ويقام في المنطقة المحيطة غشاء الخلية لإمكانات الثابتة ، في هذه الدراسات ، 0 بالسيارات. هذا لا يعني عدم وجود الحالية تطبق على غشاء الخلية. إشارة قياس الفولتية في المشبك هو في الواقع كمية الحالية المطبقة على الغشاء للحفاظ على القدرة الثابتة. لذلك ، يمكن تطبيق هذا التيار يغير من نشاط الخلايا.
تسجيلات المزدوج في نظام GnRH وتحديا من نوع خاص نظرا لعدد محدود من الخلايا العصبية GnRH وتوزيعها منتشر. للتسجيلات المزدوج لتكون ناجحة ، يجب أن تكون مستقرة جدا تتلاعب. حتى يمكن للحركة طفيفة في القطب السبب ماصة لخلع الخلايا العصبية ونهاية التسجيل. وعلاوة على ذلك ، يمكن للحركة ماصة على الخلية (على سبيل المثال ، وإعادة تحديد المواقع للتعويض عن الحركة) تغيير أنماط اطلاق النار. بعض هذه القنوات قنوات أيون الكالسيوم من نوع N حساسة ميكانيكيا : تمدد الغشاء يسبب النشاط المتكررة في تكوينات تسجيل كل من كامل الخلية والخلية المرفقة – (14). أخيرا ، يجب على النظام تتلاعب تكون قادرة على الحركة الدقيقة للغاية وسلسة. كما أشير أعلاه ، مع تسجيلات مزدوجة ، واحدة يأخذ اثنين ماصات على سطح الخلايا العصبية المختارتين سابقا في نفس الوقت ومحاولات لاغلاقعصبون. في حال نجاحها ، ثم واحد يحاول ختم الخلية الثانية. عموما ، يمكن للمرء أن لا نتوقع أن يكون ختم وتسجيل عالية الجودة مع كل محاولة. هذا ، ومع ذلك ، ويخلق مشكلة خاصة مع التسجيلات المزدوجة. إذا كان أحد غير ناجحة مع الخلايا العصبية الأولى ولكن مع فشل الثاني ، لا بد من تغيير ماصة ومحاولة خلية مختلفة. لذا ، يجب على المرء أن يكون قادرا على نقل كل هدف غمر المجهر وماصة للفي الجزء العلوي من نضح جيدا (لتغيير ماصة) دون تعطيل الخلايا العصبية مختومة بنجاح.
تنميتنا واستخدام نهج الخلية المرفقة فضفاض للتسجيلات المزدوج يمثل تقدما كبيرا في دراسة الخلايا العصبية التقنية GnRH. فمن المرجح أن تسفر عن نتائج مفيدة من شأنها أن تساعد في تحريك الحقل إلى الأمام في سياق السؤال الحاسم عما الآليات الكامنة وراء النشاط المنسق أن النتائج في إفراز هرمون نابض.
Acknowledgements
أنا ممتن لرونالد لام كالابريس ، ديتر جايجر (جامعة إيموري) وارد Yuhas (أكسون الآلات) لإجراء مناقشات تقنية مفيدة.
References
- Silverman, A. J., Knobil, E., Neill, J. D. The gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neuronal systems: immunocytochemistry. The Physiology of Reproduction. , (1994).
- Freeman, M. E., Knobil, E., Neill, J. D. The neuroendocrine control of the ovarian cycle of the rat. In: The physiology of reproduction. The Physiology of Reproduction. , (1994).
- Belchetz, P. E., Plant, T. M., Nakai, Y., Keogh, E. J., Knobil, E. Hypophysial responses to continuous and intermittent delivery of hypopthalamic gonadotropin-releasing hormone. Science. 202, 631-633 (1978).
- Maurer, J. A., Wray, S. Luteinizing hormone-releasing hormone quantified in tissues and slice explant cultures of postnatal rat hypothalami. Endocrinology. 140, 791-799 (1999).
- Harris, G. C., Levine, J. E. Pubertal acceleration of pulsatile gonadotropin-releasing hormone release in male rats as revealed by microdialysis. Endocrinology. 14, 163-171 (2003).
- Sisk, C. L., Richardson, H. N., Chappell, P. E., Levine, J. E. In vivo gonadotropin-releasing hormone secretion in female rats during peripubertal development and on proestrus. Endocrinology. 142, 2929-2936 (2001).
- Cardenas, H., Ordog, T., O’Byrne, K. T., Knobil, E. Single unit components of the hypothalamic multiunit electrical activity associated with the central signal generator that directs the pulsatile secretion of gonadotropic hormones. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 9630-9634 (1993).
- Silverman, A. J., Wilson, R., Kesner, J. S., Knobil, E. Hypothalamic localization of multiunit electrical activity associated with pulsatile LH release in the rhesus monkey. Neuroendocrinology. 44, 168-171 (1986).
- Roberts, C. B., O’Boyle, M. P., Suter, K. J. Dendrites determine the contribution of after depolarization potentials (ADPs) to generation of repetitive action potentials in hypothalamic gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neurons. J Comput Neurosci. 26, 39-53 (2009).
- Spergel, D. J., Kruth, U., Hanley, D. F., Sprengel, R., Seeburg, P. H. GABA- and glutamate-activated channels in green fluorescent protein-tagged gonadotropin-releasing hormone neurons in transgenic mice. J Neurosci. 19, 2037-2050 (1999).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol Reprod. 27, 327-339 (1982).
- Gee, D. M., Flurkey, K., Finch, C. E. Aging and the regulation of luteinizing hormone in C57BL/6J mice: impaired elevations after ovariectomy and spontaneous elevations at advanced ages. Biol Reprod. 28, 598-607 (1983).
- Anson, B. D., Roberts, W. M., Walz, W., Boulton, A. A., Baker, G. B. Loose-patch voltage-clamp technique. Neuromethods, Patch-clamp analysis: Advanced techniques. 35, 265-286 (2002).
- Calabrese, B., Tabarean, T., Juranka, P., Morris, C. E. Mechanosensitivity of N-type calcium channel currents. Biophys J. 83, 2560-2574 (2002).
- Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. Rapid killing of single neurons by irradiation of intracellularly injected dye. Science. 206, 702-704 (1979).
- Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice. J Physiol. 550, 159-167 (2003).
