Doppio registrazioni somatica da Gonadotropina-Releasing Hormone (GnRH) Neuroni Identificato da una proteina fluorescente verde (GFP) in fette ipotalamici

Sezioni di cervello ipotalamici sono preparati, incubate e trasferiti alla camera di registrazione come precedentemente dettagliato (9) negli animali il cui neuroni GnRH esprimere una proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore peptide GnRH (10). Dopo la rimozione del cervello dall'animale, il cervello è bloccato con una lama di rasoio per eliminare le regioni che non sono di interesse. Al fine di determinare le regioni di rimuovere, il cervello è posto sulla sua superficie dorsale in modo che l'ipotalamo possono essere visualizzati. Per entrambi gli orientamenti fetta coronale e sagittale, il cervelletto viene rimosso. Per la preparazione fetta coronale, la porzione rostrale della corteccia è stato rimosso. In questo orientamento fetta, le regioni della corteccia laterale forniscono il supporto per affettare il cervello e fornire spazio sufficiente di cervello per il posizionamento di fili d'argento per proteggere il cervello nella camera di registrazione. Per la preparazione fetta sagittale, le regioni laterali del cervello vengono rimossi e la parte rostrale della corteccia fornisce il supporto per il cervello affettare e per il posizionamento di fili d'argento per proteggere il cervello nella registrazione bene. Nel corso della procedura di blocco, il cervello è continuamente inumidito con il freddo liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) usando una pipetta di vetro. Una piccola quantità di colla è posto sulla piattaforma di taglio. Il cervello viene sollevato con una spatola. ACSF eccesso viene rimosso da portare un Kimwipe alla superficie della spatola e il disegno ACSF in eccesso dal cervello. Il cervello è dolcemente scivolare in avanti sulla colla. E 'importante non toccare il cervello o spingere verso il basso su di esso per fissarlo. Il peso del cervello stesso è solitamente sufficiente per assicurarsi che sia sicuro. Il cervello e la piattaforma di taglio è poi fissato per il microtomo vibrante e il taglio bene è pieno di freddo ACSF. La soluzione fredda entrambe le aziende il cervello e può proteggere da eventuali danni durante la procedura di taglio. Differenti regioni del cervello variano nel grado di freddezza che ottimizza fette di qualità. La temperatura del ACSF per la preparazione di fette ipotalamo è generalmente 0 ° C. Fette devono essere tagliate ogni fetta lentamente e dovrebbe fluttuare liberamente lontano dal cervello. Se le slice cominciano ad arricciarsi durante il taglio, la velocità con cui avanza la lama deve essere rallentato. Si può utilizzare un piccolo pennello di vernice a fette uncurl ma questo non rischia di danneggiare le fette e, quindi, dovrebbe essere evitato. Lentamente, la velocità di avanzamento della lama è preferibile usare un pennello. Come ogni fetta è tagliato dal cervello, si è ritirato dalla camera di taglio e posto in una camera di incubazione fetta in un bagno di acqua calda (circa 32 ° C). La fetta incubatore è continuamente fornito con l'ossigeno con una miscela di 95% O 2 e il 5% di CO 2. In generale, pre-registrazione va incubazione fetta da 30 minuti a 2 ore. Pipette di vetro (3-6 MΩ) sono realizzati come descritto in precedenza (9) con un estrattore verticale. La temperatura e la durata della trazione varia in base al tipo di pipetta estrattore si usa, il tipo di vetro si usa e la durata del filamento di riscaldamento l'estrattore. La forma del puntale può anche variare a seconda delle preferenze dell'utente. Abbiamo raggiunto un buon successo con una punta uniformemente conica con un'apertura di 0,1 mm. Grandi aperture nella pipetta tendono a danneggiare i neuroni, mentre le aperture più piccole non riescono a portare a registrazioni di lunga durata. Pipette rivestito con Sylgard per ridurre la capacità. Puntali sono leggermente tirato rivestiti con Sylgard 184 con una pipetta secondo. Suggerimenti Sylgarded sono poi calore curato con una pistola di calore. Queste pipette vengono poi riempite con il perfusato bagno. Per aumentare la visualizzazione dei puntali, una piccola quantità di Alexa-568 si aggiunge alla parte della soluzione da bagno da utilizzare come soluzione pipetta prima di riempire le pipette. Noi non pesare i Alexa-568, ma piuttosto l'uso abbastanza per girare la rosa soluzione ad occhio. Il puntali possono poi essere visualizzate sotto il filtro rosso Texas. Abbiamo sviluppato un approccio per ottenere corrente-clamp registrazioni per l'individuazione di potenziali d'azione con guarnizioni a bassa resistenza (vedi Discussione). Le registrazioni vengono effettuate a potenziale endogeno di riposo della cellula con Axoclamp 2B non applicata attuale Strumento Axon utilizzando il. Tuttavia, a causa della tenuta bassa resistenza, non in grado di rilevare potenziali d'azione con il solo amplificatore 2B. Per aumentare il segnale, un secondo amplificatore (AM Sistemi 3000) viene utilizzato in serie con la 2B Axoclamp. Questo approccio ha la facilità di foche sciolti e l'utilità di lungo periodo delle registrazioni. Tecnicamente, si può misurare direttamente i potenziali di azione, aggirando in tal modo i problemi con l'approccio del voltage-clamp modalità di registrazione (vedi Discussione). Si prende due pipette alla superficie dei due neuroni selezionati in precedenza allo stesso tempo, in modo simile come approccio per l'intera configurazione di registrazione delle cellule. Avvicinandosi entrambi neurons allo stesso tempo è stato più riuscito ad ottenere le registrazioni duale che tentare ogni neurone della coppia in modo indipendente. Durante questo tempo, gli impulsi di iniezione di corrente sono passati da amplificatore 2B come si fa durante l'avvicinamento per intero a cellule registrazioni. Pressione positiva deve essere mantenuta da entrambe le pipette per evitare l'intasamento della punta. Pressione positiva per le registrazioni duale è meglio generata utilizzando un vuoto non riempito siringa da 3 ml legata al titolare pipettare con una lunghezza del pezzo di tubo. Utilizzando siringhe permette di mantenere la pressione su entrambe le pipette. Pressione positiva dovrebbe essere applicato non appena la pipetta è stata posta nella soluzione bagno della camera di registrazione. Ci si avvicina alla neuroni selezionati con le pipette in modo sequenziale. Dopo aver posizionato la pipetta prima direttamente sopra la più grande superficie del neurone, si mantiene positivo da parte lasciando la siringa in posizione e lascia la pipetta in questa posizione. Si ritorna poi alla cima della camera di registrazione e abbassa la pipetta secondi di registrazione in posizione. Neuroni selezionati sono spesso a diversi livelli della fetta. La pipetta primo dovrebbe essere posizionato sopra il neurone che è più profondo nella fetta e posizionare la pipetta secondo al neurone più superficiali. Questo impedisce il posizionamento della pipetta secondo dal spostando il posizionamento della pipetta secondo come la fetta si sposta leggermente sul piano verticale come pipette inserire la fetta. Guarnizioni allentate (18-30 MΩ) verrà utilizzato. La pressione positiva indurrà una piccola fossetta sulla superficie di ogni cellula. Un tentativo di sigillare il primo neurone rilasciando pressione positiva e applicando molto lieve pressione negativa. La pressione positiva viene rilasciato rimuovendo la siringa. Aspirazione per via orale viene poi applicato alla estremità libera del tubo. Membrana Un neurone sano che rispondere rapidamente al rilascio di pressione positiva e di aderire alla pipetta. Aspirazione leggera formerà un sigillo con resistenza appropriata in un neurone sano. Quando si tenta di sigillare un neurone e non riesce, la pipetta non può essere riutilizzato dal membrane solo sigillo per pulire molto vetro. Invece, si solleva la pipetta (e obiettivo microscopio) di distanza dalla superficie della fetta nella parte superiore della perfusione bene, toglie la pipetta dal bagno, si trasforma in una pipetta pulita e poi torna alla fetta per tentare di sigillare un'altra cella . Per queste ragioni, è importante per selezionare più neuroni potenziale per le registrazioni. Per le fette con neuroni di registrazione meno di 4-6 qualità tra cui scegliere, il successo ad ottenere le registrazioni doppio è limitata. Dopo aver stabilito un sigillo sciolto in base alla resistenza, gli impulsi di iniezione di corrente dall'amplificatore 2B sono terminati. L'amplificatore 2B è posto in serie con l'amplificatore serie 3000. In questa configurazione, l'uscita del amplificatore 2B serve come ingresso per l'amplificatore serie 3000. L'amplificatore Quest'ultimo fornisce il segnale per l'acquisizione dati. La tenuta (punto 4) e la riconfigurazione di amplificatori (punto 5) viene quindi ripetuto per il neurone secondo. Figura 1. Un periodo di maggiore cottura in due neuroni a piede libero con GnRH configurazione di registrazione allegata sigillo in un preparato fetta sagittale. La fetta è stata derivata da un maschio castrato. Ogni deviazione verso l'alto indica un potenziale d'azione. Si noti che un neurone GnRH (traccia in alto) mostra cottura quasi continuo, mentre il secondo neurone GnRH presenta scoppi intermittenti. Questo modello di attività di singoli neuroni GnRH è simile a quella di singole unità estratte da più unità registrazioni durante la secrezione dell'ormone in vivo (7). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.