Dupla Recordings somática de Hormônio Liberador de Gonadotropina (GnRH) Neurônios Identificados por proteína verde fluorescente (GFP) em fatias Hypothalamic

Fatias de cérebro do hipotálamo são preparadas, incubadas e transferidos para a câmara de gravação como anteriormente detalhada (9) em animais cujos neurônios GnRH expressam a proteína verde fluorescente (GFP) sob o controle do promotor peptídeo GnRH (10). Após a remoção do cérebro do animal, o cérebro é bloqueado usando uma lâmina de barbear para eliminar as regiões que não são de interesse. A fim de determinar as regiões de remover, o cérebro é colocado em sua superfície dorsal, para que o hipotálamo pode ser visualizado. Tanto para as orientações corte coronal e sagital, o cerebelo é removido. Para a preparação de corte coronal, a porção rostral do córtex é removido. Nesta orientação fatia, as regiões laterais do córtex fornecer suporte para cortar o cérebro e proporcionar área suficiente do cérebro para a colocação de fios de prata para proteger o cérebro na câmara de gravação. Para a preparação fatia sagital, as regiões laterais do cérebro são removidas e as porções rostral do córtex fornecer o apoio para o cérebro corte e para a colocação de fios de prata para proteger o cérebro na gravação também. Durante todo o processo de bloqueio, o cérebro está continuamente umedecida com o frio do líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) utilizando uma pipeta de vidro. Uma pequena quantidade de Superglue é colocado na plataforma de corte. O cérebro é levantado com uma espátula. ACSF excesso é removido por trazer um Kimwipe à superfície da espátula e desenho ACSF excesso longe do cérebro. O cérebro é suavemente deslizou em frente para a cola. É importante não tocar no cérebro ou empurrar para baixo sobre ele, a fim de prendê-lo. O peso do cérebro em si é geralmente suficiente para garantir que é seguro. Do cérebro e da plataforma de corte é então presa ao micrótomo vibrando e assim o corte é preenchido com ACSF frio. A solução fria ambas as empresas o cérebro e pode proteger contra danos durante o procedimento de corte. Diferentes regiões do cérebro variam no grau de frieza que otimiza fatias de qualidade. A temperatura do ACSF para a preparação de fatias de hipotálamo é geralmente 0 ° C. Fatias devem ser cortadas de forma lenta e cada fatia deve flutuar livremente longe do cérebro. Se começar a enrolar as fatias durante o corte, a velocidade com que a lâmina está avançando deve ser retardado. Pode-se usar um pincel pequeno para fatias uncurl mas este corre o risco de danificar as fatias e, portanto, deve ser evitado. Lentamente, a velocidade de avanço da lâmina é preferido sobre o uso de um pincel. Como cada fatia é cortada a partir do cérebro, é retirado da câmara de corte e colocados em uma câmara de incubação fatia em um banho de água morna (aproximadamente 32 ° C). A fatia incubadora é continuamente fornecido com oxigênio usando uma mistura de 95% O 2 e 5% CO 2. Geralmente, os pré-gravação varia fatia de incubação de 30 minutos a 2 horas. Pipetas de vidro (3-6 mohms) são fabricados conforme descrito anteriormente (9) com um puxador vertical. A temperatura ea duração de puxar varia de acordo com o tipo de pipeta utiliza um extrator, o tipo de vidro se usa eo tempo de vida do filamento de aquecimento do extrator. A forma da ponta da pipeta também pode variar, dependendo da preferência do usuário. Temos conseguido um bom sucesso com uma ponta uniformemente cônico com uma abertura de 0,1 mm. Aberturas maiores na pipeta tendem a danificar os neurônios enquanto aberturas menores não resultarem em gravações de longa duração. Pipetas revestido com Sylgard para reduzir a capacitância. Ponteiras são levemente puxados revestido com Sylgard 184 utilizando uma pipeta segundo. Dicas Sylgarded são, então, calor curado usando uma pistola de calor. Estas pipetas são preenchidos com o perfusato banho. Para aumentar a visualização das ponteiras, uma pequena quantidade de Alexa-568 é adicionado à parte da solução de banho para ser usado como a solução da pipeta antes de preencher as pipetas. Nós não pesar o Alexa-568, mas sim usar o suficiente para transformar o pink solução por olho. As pontas da pipeta pode ser visualizado sob o vermelho Texas filtro. Nós desenvolvemos uma abordagem para obter grampo corrente gravações para a detecção de potenciais de ação usando selos de baixa resistência (ver Discussão). As gravações são realizadas em potencial endógeno das células de descanso com Axoclamp 2B não aplicada Instrumento Axon atual usando o. No entanto, devido ao selo de baixa resistência, não se poderia detectar potenciais de ação com apenas o amplificador 2B. Para aumentar o sinal, um amplificador de segunda (AM Sistemas de 3000) é usado em série com a 2B Axoclamp. Esta abordagem tem a facilidade de selos soltos e utilidade de gravações a longo prazo. Tecnicamente, pode-se medir diretamente a potenciais de ação, contornando assim os problemas com a abordagem no modo de gravação de tensão-clamp (ver discussão). Um leva duas pipetas para a superfície dos dois neurônios previamente selecionados, ao mesmo tempo, de forma semelhante como a abordagem para a configuração de toda célula de gravação. Aproximando-se tanto neurons ao mesmo tempo, tem sido mais bem sucedido em obter as gravações dupla de tentar cada neurônio do par de forma independente. Durante este tempo, os pulsos de injeção de corrente são passadas do amplificador 2B como é feito durante a aproximação para a célula inteira gravações. Pressão positiva deve ser mantida em ambas as pipetas para evitar o entupimento da ponta. Pressão positiva para as gravações é a melhor dupla gerados pela utilização de uma seringa de 3 ml por preencher vazios anexados ao titular da pipeta por um período de pedaço de tubo. Uso de seringas permite manter a pressão sobre ambos os pipetas. Pressão positiva deve ser aplicada assim que a pipeta foi colocada na solução de banho da câmara de gravação. Se aborda os neurônios selecionados com as pipetas seqüencialmente. Depois de posicionar a pipeta primeiro diretamente sobre a maior superfície do neurônio, se mantém positivo, deixando a seringa no local e deixa a pipeta nesta posição. Um retorna ao topo da câmara de gravação e reduz a pipeta segunda gravação para a posição. Neurônios selecionados são, muitas vezes em diferentes níveis da fatia. A pipeta primeiro deve ser posicionado sobre o neurônio que é o mais profundo na fatia e posição da pipeta no segundo neurônio mais superficial. Isso evita que o posicionamento da pipeta segundo de mudar o posicionamento da pipeta segundo como a fatia irá mover-se ligeiramente no plano vertical como pipetas entrar na fatia. Selos soltos (18-30 mohms) será usado. A pressão positiva irá induzir uma pequena covinha na superfície de cada célula. Uma tentativa de selar o primeiro neurônio, liberando pressão positiva e aplicação muito ligeira pressão negativa. A pressão positiva é liberado por retirar a seringa. De sucção com a boca é então aplicado à extremidade livre do tubo. Um neurônio membrana saudável irá responder rapidamente à liberação de pressão positiva e aderir à pipeta. Ligeira sucção irá formar uma vedação com resistência adequada em um neurônio saudável. Quando se tenta selar um neurônio e falhar, a pipeta não pode ser reutilizado desde membranas só selo para muito limpa vidro. Em vez disso, uma levanta a pipeta (e objetiva do microscópio) de distância da superfície da fatia para o topo da perfusão bem, remove a pipeta do banho, muda para uma pipeta limpa e depois volta para a fatia para tentar selar outra célula . Por essas razões, é importante para selecionar vários neurônios potencial para as gravações. Para fatias com menos de 4-6 neurônios qualidade de gravação de que para escolher, o sucesso na obtenção de gravações dupla é limitada. Depois de estabelecer um selo soltos com base na resistência, os pulsos de injeção de corrente do amplificador 2B são encerrados. O amplifer 2B é colocado em série com o amplificador da série 3000. Nesta configuração, a saída do amplificador 2B serve como entrada para o amplificador da série 3000. O amplifer último fornece sinal para aquisição de dados. O selo (passo 4) e reconfiguração do amplificador de (passo 5) é então repetido para o segundo neurônio. Figura 1. Um período de aumento de disparo em dois neurônios GnRH utilizando a configuração solta selo de gravação anexada em uma preparação fatia sagital. A fatia foi derivado de um macho castrado. Cada deflexão para cima indica um potencial de ação. Note-se que um neurônio GnRH (traços em cima) apresenta disparar quase contínua, enquanto o segundo GnRH neurônio apresenta rajadas intermitentes. Este padrão de atividade de neurônios individuais GnRH é semelhante ao de unidades individuais extraídas da unidade de multi-gravações durante a secreção hormonal in vivo (7). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.