Mühendislik Hücre geçirgen Protein

Ifade vektör ve ifade İnşaat: PSESAME Cre ekspresyon vektörü standart klonlama yöntemleri kullanarak AvrII ve NheI kısıtlama siteleri aracılığıyla pSESAME bir Cre-kodlama parçası takarak inşa edilmiştir. pSESAME histidin etiketi, TAT-domain, NLS sırası ve Cre, kısaltılmış HTNCre oluşan bir füzyon proteini kodlar. HTNCre ifade için pSESAME Cre TUNER (de3) pLacI dönüştü ve bir gliserol stok hazırlamak için kullanılan. Bir gece aşırı kültür gliserol stok dönüştürdü bakteri ile kaplı bir pipetlemeyin ucunu kullanarak ekildi. % 0.5 glukoz ile desteklenmiş LB medya oluşan aşırı gece kültür [v / v] ve 50 mcg / mL nihai konsantrasyonda carbenicillin ve 37 büyümeye izin ° C de 16 saat boyunca. Ertesi gün yoğun olarak yetiştirilen üzerinde gece kültürü 1 ila 40 arasında bir oranı ifade kültürünü aşılamak için kullanılan ve 37 ° C'de bir inkübatör konuldu İfade kültürü, son bir 100 mcg / mL konsantrasyonda% 0.5 'lik glukoz [v / v] ve ampisilin ile desteklenmiş TB medya oluşuyordu. OD 595 1.5 ifade kültürü 1 saat için 0.5 mM IPTG ile indüklenen Daha sonra bakteri SLA3000 rotor 10 dakika 5000 rpm'de santrifüj yoluyla toplanmıştır. Bakteriler pelet eksi 20 ° C arıtma kadar saklandı. Hücre geçirgen protein saflaştırılması: Dondurulmuş bakteri pelet oda sıcaklığında 15 dakika başına 10 litre şişesi kültür mL lizis tamponu yeniden süspanse edildi. Süspansiyon sonra oda sıcaklığında karıştırılması sırasında, ek 15 dakika boyunca 1 mg / ml lizozim inkübe edildi. 25 U / ml Benzonase sonra eklenir ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karıştırma inkübe edildi. Gücünün% 45 0,5 darbeleri ile 1.5 dakika süreyle buz sonification sonra, 1 ml soğuk tartarik tuz tamponu (TSB) başına ml süspansiyon dikkatle süre eklendi karıştırma ve buz üzerinde 5 dakika inkübe. SDS-PAGE lizat fraksiyonu (L) örnek alındı. Temizlendi lizat ° C 'de 30 dakika 30.000 g. 4 santrifüj yoluyla elde edildi Çözünür (S) ve çözünmez fraksiyonları (I) SDS-PAGE örnekleri alındı. Süpernatant taze 50 ml şahin tüpler içine transfer oldu ve 4 az 1 saat sonra hafifçe karıştırılır ° C,% 50 Ni-NTA bulamaç ilk ifade kültür litre başına 2 ml. Süspansiyon gravite akışı EconoPac sütunu (fraksiyonu akış ile alınmıştır (FT) SDS-PAGE örnek) ile paketlenir ve 5 yatak yıkama tampon hacimleri ile iki kez yıkandı. Hem yıkama fraksiyonları (W1 ve W2) SDS-PAGE örnekleri alındı. HTNCre içeren fraksiyonlar eluat fraksiyonu (E) SDS-PAGE analizi için elüsyon tampon ve örnek 3 yatak hacimleri ile yıkandı alınmıştır. Imidazol yüksek tuz tamponu iki kez karşı elüsyon fraksiyonu diyaliz tarafından kaldırıldı. Protein solüsyonu gliserol tampon karşı iki kez diyaliz daha fazla konsantre oldu. Tüm diyaliz adımları örnek tampon oranı en az 50 oldu. Bu prosedür, 200 ve 450 mcM arasında bir normal konsantrasyonda HTNCre içeren bir gliserol stok solüsyonu ile sonuçlandı, yani 1 litre ifade kültür ~ 12 mg protein neden olacaktır. Gliserol stoku (GS) SDS-PAGE analizi için örnek toplanmıştır. HTNCre stok solüsyonu eksi 20 saklanabilir ° C Şekil 1: Cre recombinase saflaştırma işlemi sırasında toplanan örneklerin SDS-PAGE analizi. Cre ifade İndüksiyon lizat fraksiyonu egemen grup tarafından gösterilir. Çözünmeyen protein bir parçası olmakla birlikte, eluat ve gliserol stok kesirler görüldüğü gibi Cre proteini daha zenginleştirilmiş olabilir. L: Lizat: çözünmez, S: Süzüntü FT: Akış, W: Yıkama, E: Eluat, GS: Gylcerol Stok. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız . Fare embriyonik kök (ES) hücrelerin içine protein transdüksiyon: Bir koşullu β-galaktosidaz muhabiri 5 inşa taşıyan ES hücrelerinin yapışık hücrelere disosiasyon için TrypLE ™ Express kullanan tek bir hücre olarak seribaşı. 4 ila 6 saat sonra hücrelerin yeniden bağlı olan ve orta kaldırıldı. Daha sonra ES hücrelerinin, 16 saat süreyle HTNCre içeren orta inkübe edildi. Gliserol stokunun HTNCre protein uygun bir miktar (10 mcM karşılık), ES, orta ve daha sonra steril filtre (0.22 mm) içine sulandırılmış oldu. Protein transdüksiyon orta normal büyüme ortamına geri çevrildikten sonra. Iki gün hücreler PBS ile yıkanmış ve 10 dakika için% 4 Paraformaldehit (PFA) ile fikse edildi. İki ekPBS ile fonksiyonel yıkama adımları X-Gal boyama yapıldı önce idam edildi. Sabit hücreleri X-Gal boyama çözüm 6 bir tabaka ile kaplıdır ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edildi. Temsilcisi Sonuçlar: Ertesi gün X-Gal boyama çözüm talip oldu ve hücreler PBS mikroskopi analizi için bir tabaka ile kaplıydı. Recombined hücreleri 80 -% 100 β-galaktosidaz aktivitesi tarafından değerlendirilecektir fare ES hücrelerinin içinde gözlenebilmektedir.