Engineering zellpermeablen Protein
Summary
Protein Transduktion ermöglicht die direkte Abgabe von biologisch aktiven Proteinen in Zellen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden wie DNA-Transfektion oder virale Transduktion dieser nicht-invasiven Paradigma ermöglicht hoch effiziente zelluläre Manipulation in eine titrierbare Weise umgehen zelluläre Toxizität und das Risiko der onkogenen Transformation durch permanente genetische Veränderung.
Abstract
Das Protein Transduktion Technik ermöglicht die direkte Abgabe von biologisch aktiven Materials in Säugerzellen [zur Übersicht siehe 1,2]. Für diese Verwendung des translozierenden Fähigkeit der sogenannten Zell-penetrierende Peptide (CPP) machen kann, auch als Proteintransduktionsdomänen (PTDs) bezeichnet. Das TAT-CPP aus dem humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) Tat (trans-Aktivator der Transkription)-Protein wurde in großem Umfang eingesetzt abgeleitet. Die positiv geladenen TAT fördert Zellpermeabilität damit die Überwindung der Barrieren der Zellmembran durch Endozytose und / oder direkte Membranpenetration 2. In Kombination mit einem Kernlokalisierungssignal (NLS) Fusionsproteine sind in der Lage, den Kern aufweisen Funktionalität geben. Unsere Video-Präsentation demonstriert, wie eine Veranschaulichung für das Engineering von zellpermeablen Proteine, die Konstruktion, Produktion und Anwendung eines zellpermeablen Version des DNA-modifizierende Enzyme Cre.
Cre ist eine ortsspezifische Rekombinase, die in der Lage zu erkennen und zu rekombinieren 34 Basenpaar loxP-Stellen in Säugetierzellen in vitro und in vivo ist. Deshalb ist die Cre / loxP-System ist weit verbreitet bedingt induzieren Mutationen im Genom lebender Zellen 3,4. Die Lieferung von aktiven Cre-Rekombinase zu Zellen, stellt jedoch eine Einschränkung.
Wir beschreiben die pSESAME Vektor-System, das eine direkte Insertion des Gens-of-Interest können und bietet eine Plattform, um schnell Klon unterschiedlichen Domänen und-Tags innerhalb des Vektors in eine komfortable und standardisierte Art und Weise verwendet. Umstellen der verschiedenen tags wurde gezeigt, dass die biochemischen Eigenschaften der Fusionsproteine bietet die Möglichkeit, höhere Ausbeute und bessere Löslichkeit zu erreichen ändern. Wir zeigen, wie zu äußern und zu reinigen rekombinanten Zell-Permeationsmittel Proteine in und aus E. coli. Die Funktionalität des rekombinanten Proteins ist Cre schließlich in der Zellkultur durch die Bewertung ihrer intrazellulären Rekombinase-Aktivität geprüft.
Protocol
Discussion
Während des Reinigungsprozesses des Cre-Fusionsprotein ist es wichtig, nicht auf die Zugabe von eiskaltem TBS-Puffer vor dem Zentrifugieren weglassen. Ansonsten Rekombinase Cre tendenziell Niederschlag in der Glycerin-Puffer.
Wenn die Eluatfraktion scheint trüb aufgrund der hohen Konzentration des Fusionsproteins zusätzliche Elutionspuffer sollte hinzugefügt werden, bis die Lösung wieder gelöscht hat.
Die Anwendung von 10 pM Cre-Fusionsprotein führt in der Regel eine Rekombination Effizienz von 80 bis 100%. Fötalem Kälberserum (FCS), ein wichtiger Bestandteil der ES-Zell-Medium stark hemmt Proteintransduktionsdomäne. Deshalb hohe Konzentration von Cre-Rekombinase eingesetzt werden mussten. Bei der Arbeit in serum-freien Bedingungen weniger Protein (0,5 bis 2 M) kann verwendet werden, um ähnliche Rekombination Wirkungsgrade zu erreichen.
Mit dem pSESAME Vektor-System zur Hand kann man die Technik der Proteintransduktionsdomäne an andere Proteine einschließlich Transkriptionsfaktoren wie Oct4 und Sox2 7 und 8 gelten Scl/Tal1.
Acknowledgements
Wir danken Oliver Brüstle und alle Mitglieder des Stem Cell Engineering Group, Universität Bonn, für die Unterstützung und wertvolle Diskussionen. Wir bedanken uns bei Sabine Schenk für die Vorbereitung des SDS-PAGE und dauerhafte Unterstützung während des gesamten Projekts. Nicole Russ und Anna Magerhans vorgesehen ausgezeichneten technischen Support. Darüber hinaus möchten wir Andreas Bär und Sheila Mertens für die Produktion des Films zu danken. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Volkswagen-Stiftung (Az I/77864) und dem deutschen Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF, 01 GN 0813) unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| TUNER (DE3) pLacI | Novagen | 70625 | ||
| Glycerol | Carl Roth | 3783.2 | ||
| Na2HPO4 | Roth | T876.1 | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | ||
| HCl | Roth | 4625.1 | ||
| Imidazol | Roth | X998.4 | ||
| NaCl | Roth | 9265.2 | ||
| Yeast Extract | Roth | 2363.4 | ||
| Trypton/Pepton | Roth | 8952.4 | ||
| K2HPO4 | Roth | P749.2 | ||
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | ||
| Ampicillin | Sigma | A9518 | ||
| Carbenicillin | Sigma | 6344.2 | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | ||
| Lysozyme | Sigma | 62971 | ||
| Benzonase | Novagen | |||
| L-Tartaric acid, disodium salt | Sigma | |||
| 50% Ni-NTA slurry | Invitrogen | R901-15 | ||
| EconoPac columns | Biorad | 732-1010 | ||
| Sterile filter 0,22μm | Whatman | |||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | |||
| LB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl | |||
| TB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4 | |||
| Lysis Buffer | 50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8 | |||
| Tartaric Salt Buffer (TSB) | PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol | |||
| Washing Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol | |||
| Elution Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol | |||
| High Salt Buffer | 600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | |||
| Gylcerol Buffer | 50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | |||
| TrypLE™ Express | Invitrogen | |||
| ESGRO (LIF) | Millipore | |||
| NEAA | Gibco | 11140035 | ||
| L-Glutamin | Gibco | 25030024 | ||
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | ||
| DMEM | Gibco | 11960044 | ||
| PBS | Gibco | |||
| Fetal Calf Serum (FCS) | PAA | |||
| X-Gal staining solution: | 4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS |
|||
| K3(FeIII(CN)6) | Sigma | P-3367 | ||
| K4 (FeII(CN)6) | Sigma | P-9387 | ||
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ||
| X-Gal | Sigma | B4252 |
References
- Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).
- Edenhofer, F. Protein transduction revisited: novel insights into the mechanism underlying intracellular delivery of proteins. Curr Pharm Des. 14 (34), 3628-3636 (2008).
- Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. Dev Cell. 6 (1), 7-28 (2004).
- Nolden, L. Site-specific recombination in human embryonic stem cells induced by cell-permeant Cre recombinase. Nat Methods. 3 (6), 461-467 (2006).
- Zhang, Y. Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 24 (4), 543-548 (1996).
- Peitz, M. Enhanced purification of cell-permeant Cre and germline transmission after transduction into mouse embryonic stem cells. Genesis. 45 (8), 508-517 (2007).
- Bosnali, M., Edenhofer, F. Generation of transducible versions of transcription factors Oct4 and Sox2. Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).
- Landry, J. R. Runx genes are direct targets of Scl/Tal1 in the yolk sac and fetal liver. Blood. 111 (6), 3005-3014 (2008).
