エンジニアリング細胞透過性のタンパク質

発現ベクターおよび発現の建設： pSESAME – Creを発現ベクターは、標準的なクローニング方法を使用してAvrIIおよびNheI制限部位を介してpSESAMEにCreをコードする断片を挿入することにより構築した。 pSESAMEはヒスチジン – タグ、TAT -ドメイン、NLS配列とCre、略称HTNCreで構成される融合タンパク質をコードしている。 HTNCreの発現のためpSESAME – CreをはTUNER（DE3）pLacIに変換してグリセロールストックを調製した。 一晩培養物は、グリセロールストックから形質転換した細菌をコーティングしたピペットチップを用いて接種した。オーバーナイト培養液は、濃度50μg/ mlの最終濃度で0.5％のグルコース[V / V]とカルベニシリンを補充したLB培地で構成され、37で成長させた℃で16時間C。 次の日密栽培オーバーナイト培養液を1〜40の割合で発現培養を接種したと37℃のインキュベーターに入れ、発現培養は100μg/ mlの最終濃度で0.5％のグルコース[V / V]とアンピシリンを添加したTBメディアから成っていた。 1.5のOD 595で発現培養を1時間では0.5 mMのIPTGで誘導したその後、細菌はSLA3000ローターで10分間5000rpmで遠心分離によって回収した。 バクテリアペレットは-20℃で精製されるまで保存されていました。 細胞透過性のタンパク質の精製： 冷凍細菌ペレットを室温で15分間リットルのフラスコの培養液あたり10mLの溶解バッファーに再懸濁した。 室温で混合しながら次いで、この懸濁液をさらに15分間に1 mg / mLのリゾチームとインキュベートした。 25 U / mLのベンゾナーゼはその後加え、室温で15分間混合しながらインキュベートした。 混合し、氷上で5分間インキュベートしながら電力の45％で0.5秒のパルスで1.5分、1 mLの冷酒石酸塩緩衝液（TSB）氷上で超音波処理した後1mLあたり懸濁液を注意深く加えた。ライセート分画（L）のSDS – PAGEのサンプルを採取した。 清澄化ライセート℃で30分間30,000 gで4℃で遠心分離によって得られた水溶性（S）と不溶性画分（I）のSDS – PAGEのサンプルを採取した。 上清を新しい50mlファルコンチューブに移し、4℃で1時間の初期発現培養リットル当たり50％のNi – NTAのスラリーを2mLとCのためにして穏やかに混合したれました。 懸濁液を重力流EconoPacのカラムに充填（フロースルーフラクション（FT）のSDS – PAGEのサンプルが取られた）と洗浄バッファーの5ベッドボリュームで2回洗浄した。両方の洗浄画分（W1＆W2）のSDS – PAGEのサンプルを採取した。 HTNCre含有画分をSDS – PAGE解析のための溶出画分の溶出緩衝液と試料（E）の3ベッドボリュームで溶出された取られた。 イミダゾール二回高塩緩衝液に対して溶出画分を透析により除去した。 タンパク質溶液は、さらに2回グリセロール緩衝液に対して透析により濃縮した。すべての透析の手順でサンプルへのバッファの比率は少なくとも50あった。この手順は、200および450μMの間で通常の濃度でHTNCreを含むグリセロールストック溶液をもたらした、すなわち発現培養1リットルは、タンパク質の約12ミリグラムになります。 SDS – PAGE解析のためのグリセロールストック（GS）のサンプルを採取した。 HTNCreストック溶液は、マイナス20℃で保存することができます 図1：Creリコンビナーゼの精製の ​​過程で収集されたサンプルのSDS – PAGE分析。 Creリコンビナーゼの発現誘導は、ライセート画分における支配的なバンドで示されます。タンパク質の一部が不溶性であるが溶出液とグリセロールストックの分画に見られるようにCREのタンパク質をさらに充実させることができます。 L：ライセート、I：不溶性、S：上清を、FT：フロースルー、W：洗浄、E：溶出液、GS：Gylcerolストック。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。 マウス胚性幹（ES）細胞へのタンパク質導入： 条件付きのβ-ガラクトシダーゼレポーター5コンストラクトを運ぶES細胞は接着細胞の解離のためTrypLE™Expressを使用して、単一の細胞として播種した。 4〜6時間後に細胞を再装着していたと培地を除去した。 その後、ES細胞は、16時間HTNCre含有培地でインキュベートした。 グリセロールストックからHTNCre蛋白質の適切な量（10μMに相当）は、ES培地と続いて無菌ろ過（0.22μmの）中に希釈した。 タンパク質導入後の培地は、通常の増殖培地に戻って変更されました。 二日間の細胞をPBSで洗浄し、10分間4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定した後。 さらに2X – gal染色を行う前にPBSでtional洗浄ステップが実行されました。 固定された細胞は、X – gal染色液6の層で覆い、37℃で一晩インキュベートした。 代表的な結果： 翌日、X – gal染色液を熱望し、細胞を顕微鏡分析のためのPBSの層で覆われていた。組換え細胞の80〜100％がβ-ガラクトシダーゼ活性が判断したマウスES細胞内で観察することができた。