הנדסה Cell-חדיר חלבון

בנייה של וקטור הביטוי הביטוי: וקטור pSESAME-Cre ביטוי נבנה על ידי הוספת קטע Cre קידוד לתוך pSESAME דרך אתרי AvrII ו NheI הגבלה באמצעות שיטות שיבוט סטנדרטיות. pSESAME מקודד חלבון איחוי המורכב תג-היסטידין, TAT-תחום, רצף NLS ו Cre, מקוצר HTNCre. עבור ביטוי HTNCre pSESAME-Cre הפך (DE3) TUNER pLacI ומשומשים להכין מלאי גליצרול. תרבות על הלילה היה מחוסן באמצעות קצה pipet מצופה חיידקים הפך ממלאי גליצרול. תרבות הלילה מעל כללה התקשורת LB בתוספת גלוקוז 0.5% [v / v] ו carbenicillin בריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו הורשה לגדול ב 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. למחרת גדל בצפיפות יתר לילה תרבות שימש לחסן את התרבות ביטוי ביחס של 1 עד 40 ו הושם באינקובטור ב 37 ° C. תרבות הביטוי כללה התקשורת TB בתוספת גלוקוז 0.5% [v / v] ו אמפיצילין בריכוז הסופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל. ב OD 595 של 1.5 תרבות הביטוי היה מושרה עם IPTG 0.5 מ"מ 1 ח כתוצאה מכך חיידקים נאספו על ידי צנטריפוגה בסל"ד 5000 למשך 10 דקות בתוך הרוטור SLA3000. כדורי חיידקים היו מאוחסנים בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד לטיהור. טיהור של חלבון התא חדיר: חיידקים קפואים כדורי היו resuspended במאגר מ"ל 10 תמוגה לכל תרבות בקבוק ליטר במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. השעיה הודגר אז עם ליזוזים מ"ג / מ"ל ​​1 במשך 15 דקות נוספות תוך ערבוב בטמפרטורת החדר. 25 U / mL benzonase נוספה לאחר מכן מודגרות תוך ערבוב במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר sonification על קרח דק 1.5 עם פולסים של 0.5 ב 45% של הכוח, 1 מ"ל מלח קר חיץ טרטרית (TSB) לכל מ"ל ההשעיה נוספה בקפידה תוך ערבוב במשך 5 דקות מודגרות על הקרח. SDS-PAGE מדגם של חלק lysate (L) נלקח. Lysate פינה הושג על ידי צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב 30,000 g. SDS-PAGE דוגמאות של שברים מסיסים (S) מסיסים (אני) נלקחו. Supernatant הועבר לתוך צינורות טרי 50 מ"ל בז והיה מעורב אז בעדינות במשך שעות 1 על 4 ° C עם 2 מ"ל של 50% Ni-נ.ת. ע slurry לליטר של תרבות הביטוי הראשוני. ההשעיה היה דחוס לתוך טור זרימת הכבידה EconoPac (SDS-PAGE מדגם של זרימה דרך שבריר (FT) נלקח) ורחץ פעמיים עם 5 למיטה כרכים של חיץ כביסה. SDS-PAGE דגימות של שני שברים כביסה (W1 & W2) נאספו. HTNCre המכילים שברים היו eluted עם 3 המיטה כרכים של חיץ elution מדגם של חלק eluate (ה) לצורך ניתוח SDS-PAGE נלקח. Imidazole הוסר על ידי dialyzing חלק elution נגד המאגר מלח גבוה פעמיים. הפתרון חלבון היה מרוכז יותר על ידי dialyzing נגד המאגר גליצרול פעמיים. בכל השלבים דיאליזה יחס חיץ המדגם היה לפחות 50. הליך זה הביא לפתרון גליצרול המכיל מניות HTNCre בריכוז הרגיל בין 200 ל 450 מיקרומטר, כלומר, 1 ליטר של תרבות הביטוי תגרום ~ 12 מ"ג של חלבון. דוגמאות של מניות גליצרול (GS) לניתוח SDS-PAGE נאסף. פתרון HTNCre המניות יכולים להיות מאוחסנים בטמפרטורה של מינוס 20 ° C. איור 1: SDS-PAGE ניתוח של דגימות שנאספו במהלך תהליך טיהור Cre recombinase. אינדוקציה של ביטוי Cre הוא הצביע על ידי הלהקה הדומיננטי חלק lysate. אמנם חלק של החלבון היא חלבון מסיס Cre ניתן להעשיר עוד יותר כפי שניתן לראות eluate ומלאי שברים גליצרול. L: lysate, אני: מסיסים, S: Supernatant, FT: זרימה דרך, W:, E כביסה: Eluate, GS: במלאי Gylcerol. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1. חלבון התמרה לתוך Murine גזע עובריים (ES) התאים: תאים ES נושא מותנה β-Galactosidase 5 לבנות הכתב היו זורעים כמו תאים בודדים באמצעות TrypLE ™ Express עבור ניתוק של תאים חסיד. לאחר 4 עד 6 שעות התאים לו מחדש מצורף המדיום הוסר. בהמשך תאים ES הודגרו עם המדיום HTNCre המכילים במשך 16 שעות. כמות נאותה של חלבון HTNCre (המקביל ל 10 מיקרומטר) מתוך המלאי גליצרול היה מדולל לתוך מדיום ES ו filtrated סטרילי לאחר מכן (0.22 מיקרומטר). לאחר התמרה בינוני חלבון שונה בחזרה בינוני צמיחה נורמלית. לאחר שני תאים ימים נשטפו עם PBS וקבוע עם Paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 10 דקות. שני addiצעדים כביסה tional עם PBS הוצאו להורג לפני X-Gal מכתים בוצעה. תאים קבוע היו מכוסים בשכבה של פתרון ה-X גל מכתים 6 וטופחו על הלילה 37 ° C. נציג תוצאות: למחרת X-Gal פתרון מכתים היה שאף והתאים היו מכוסים בשכבה של PBS לניתוח במיקרוסקופ. 8-10% של תאים recombined יכול להיבחן בתוך תאים ES Murine להישפט על ידי פעילות β-Galactosidase.