Ingegneria Cell-permeabile proteine
Summary
Trasduzione proteina consente la fornitura diretta di proteine biologicamente attive nelle cellule. A differenza dei metodi tradizionali come la transfezione di DNA o di trasduzione virale questo non invasivo consente paradigma altamente efficiente manipolazione cellulare in modo titolabile eludere tossicità cellulare e il rischio di trasformazione oncogena permanente da modificazione genetica.
Abstract
La tecnica di trasduzione proteina consente la fornitura diretta di materiale biologicamente attivo nelle cellule dei mammiferi [per una rassegna vedi 1,2]. Per questo si può fare uso delle capacità translocating dei cosiddetti peptidi cellula penetrando (CPP), designato anche come domini di trasduzione delle proteine (PTDs). La TAT-CPP derivati dal virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) Tat (trans-attivatore della trascrizione), proteina è stato ampiamente utilizzato. La carica positiva TAT promuove la permeabilità cellulare superando così le barriere della membrana cellulare per endocitosi o / e la penetrazione diretta della membrana 2. In combinazione con un segnale di localizzazione nucleare (NLS), proteine di fusione sono in grado di entrare nel nucleo funzionalità espositiva. La nostra presentazione video dimostra, come esemplificazione per l'ingegneria delle cellule permeabili le proteine, la costruzione, la produzione e l'applicazione di una cellula-permeabile versione del DNA modificanti enzima Cre.
Cre è una ricombinasi sito-specifiche in grado di riconoscere e ricombinare base di 34 siti loxP coppia in cellule di mammifero in vitro e in vivo. Pertanto, il Cre / loxP sistema è ampiamente utilizzato per indurre condizionalmente mutazioni nel genoma delle cellule viventi 3,4. La consegna dei attivo Cre ricombinasi alle cellule, tuttavia, rappresenta una limitazione.
Noi descriviamo il sistema vettore pSESAME, che permette un inserimento diretto del gene d'interesse e offre una piattaforma per clonare rapidamente domini diversi e tag utilizzati all'interno del vettore in maniera comoda e standardizzata. Riorganizzazione dei tag diversi ha dimostrato di modificare le proprietà biochimiche delle proteine di fusione che fornisce la possibilità di ottenere una maggiore resa e una migliore solubilità. Dimostriamo come esprimere e purificare cellule ricombinanti permeanti proteine e da E. coli. La funzionalità della proteina ricombinante Cre è finalmente convalidato nelle cellule in coltura per valutare la sua attività intracellulare ricombinasi.
Protocol
Discussion
Durante il processo di purificazione della proteina di fusione Cre è importante non tralasciare l'aggiunta di buffer di ghiaccio freddo TBS prima centrifugazione. Altrimenti Cre ricombinasi tende a precipitare all'interno del buffer glicerolo.
Se la frazione eluato sembra diventare torbido a causa della concentrazione di buffer di eluizione delle proteine di fusione, aggiungere fino a quando la soluzione ha eliminato di nuovo.
L'applicazione di 10 mM di proteina di fusione Cre risultati in genere in un efficienza ricombinazione tra 80 e 100%. Di siero fetale bovino (FCS) è un componente importante della media delle cellule ES inibisce fortemente trasduzione delle proteine. Pertanto alta concentrazione di Cre ricombinasi doveva essere usato. Quando si lavora nel siero senza condizioni meno proteine (0,5-2 mM) può essere utilizzato per ottenere efficienze ricombinazione simili.
Con il sistema vettoriale pSESAME a portata di mano si può applicare la tecnica di trasduzione di proteine ad altre proteine tra cui fattori di trascrizione come Oct4 e Sox2 Scl/Tal1 7 e 8.
Acknowledgements
Ringraziamo Oliver Brüstle e tutti i membri del Gruppo Engineering Cellule Staminali, Università di Bonn, per il supporto e discussioni importanti. Ringraziamo Sabine Schenk per la preparazione di SDS-PAGE e supporto duraturo in tutto il progetto. Nicole Russ e Magerhans Anna fornito un eccellente supporto tecnico. Inoltre, vorremmo ringraziare Andreas Bär e Mertens Sheila per la produzione del film. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della Fondazione Volkswagen (Az I/77864) e dal Ministero tedesco dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF, 01 GN 0813).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| TUNER (DE3) pLacI | Novagen | 70625 | ||
| Glycerol | Carl Roth | 3783.2 | ||
| Na2HPO4 | Roth | T876.1 | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | ||
| HCl | Roth | 4625.1 | ||
| Imidazol | Roth | X998.4 | ||
| NaCl | Roth | 9265.2 | ||
| Yeast Extract | Roth | 2363.4 | ||
| Trypton/Pepton | Roth | 8952.4 | ||
| K2HPO4 | Roth | P749.2 | ||
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | ||
| Ampicillin | Sigma | A9518 | ||
| Carbenicillin | Sigma | 6344.2 | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | ||
| Lysozyme | Sigma | 62971 | ||
| Benzonase | Novagen | |||
| L-Tartaric acid, disodium salt | Sigma | |||
| 50% Ni-NTA slurry | Invitrogen | R901-15 | ||
| EconoPac columns | Biorad | 732-1010 | ||
| Sterile filter 0,22μm | Whatman | |||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | |||
| LB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl | |||
| TB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4 | |||
| Lysis Buffer | 50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8 | |||
| Tartaric Salt Buffer (TSB) | PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol | |||
| Washing Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol | |||
| Elution Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol | |||
| High Salt Buffer | 600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | |||
| Gylcerol Buffer | 50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | |||
| TrypLE™ Express | Invitrogen | |||
| ESGRO (LIF) | Millipore | |||
| NEAA | Gibco | 11140035 | ||
| L-Glutamin | Gibco | 25030024 | ||
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | ||
| DMEM | Gibco | 11960044 | ||
| PBS | Gibco | |||
| Fetal Calf Serum (FCS) | PAA | |||
| X-Gal staining solution: | 4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS |
|||
| K3(FeIII(CN)6) | Sigma | P-3367 | ||
| K4 (FeII(CN)6) | Sigma | P-9387 | ||
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ||
| X-Gal | Sigma | B4252 |
References
- Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).
- Edenhofer, F. Protein transduction revisited: novel insights into the mechanism underlying intracellular delivery of proteins. Curr Pharm Des. 14 (34), 3628-3636 (2008).
- Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. Dev Cell. 6 (1), 7-28 (2004).
- Nolden, L. Site-specific recombination in human embryonic stem cells induced by cell-permeant Cre recombinase. Nat Methods. 3 (6), 461-467 (2006).
- Zhang, Y. Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 24 (4), 543-548 (1996).
- Peitz, M. Enhanced purification of cell-permeant Cre and germline transmission after transduction into mouse embryonic stem cells. Genesis. 45 (8), 508-517 (2007).
- Bosnali, M., Edenhofer, F. Generation of transducible versions of transcription factors Oct4 and Sox2. Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).
- Landry, J. R. Runx genes are direct targets of Scl/Tal1 in the yolk sac and fetal liver. Blood. 111 (6), 3005-3014 (2008).
