هندسة الخلايا المنفذة للبروتين
Summary
تنبيغ البروتين يمكن التسليم المباشر للبروتينات نشطة بيولوجيا في الخلايا. على النقيض من الأساليب التقليدية مثل الحمض النووي أو تنبيغ ترنسفكأيشن الفيروسي هذا النموذج غير الغازية يسمح التلاعب الخلوية كفاءة عالية بطريقة المعايرة التحايل السمية الخلوية ومخاطر التحول من خلال التعديل الوراثي أنكجنيك دائمة.
Abstract
تقنية تنبيغ البروتين يمكن التسليم المباشر للمواد نشطة بيولوجيا في خلايا الثدييات [انظر لاستعراض 1،2]. لهذا يمكن للمرء أن الاستفادة من القدرة translocating من الببتيدات الخلية يسمى اختراق (CPPS) ، كما عينت المجالات تنبيغ البروتين (PTDs). وتات لحزب الشعب الكمبودي المستمدة من نوع فيروس نقص المناعة البشرية 1 (HIV – 1) تم تات (العابرة للمنشط من النسخ) بروتين يستخدم على نطاق واسع. وتات المشحونة إيجابيا يعزز نفاذية الخلية وبالتالي التغلب على الحواجز في الغشاء الخلوي عن طريق الإلتقام و / أو اختراق الغشاء مباشرة 2. بالاشتراك مع اشارة توطين النووي (NLS) البروتينات الانصهار قادرون على دخول وظائف النواة العارضة. فيديو يوضح العرض الذي قدمناه ، باعتبارها التمثيل للهندسة الخلية المنفذة للبروتينات ، والبناء ، والإنتاج وتطبيق صيغة خلية قابلة للاختراق من لجنة المساواة العرقية الانزيم تعديل الحمض النووي.
لجنة المساواة العرقية هو recombinase مواقع محددة قادرة على الاعتراف وإعادة تجميع 34 موقعا loxP قاعدة الزوج في خلايا الثدييات في المختبر والمجراة. ولذلك يستخدم على نطاق واسع في نظام لجنة المساواة العرقية / loxP مشروط للحث على طفرات في الجينوم للخلايا الحية 3،4. تسليم لجنة المساواة العرقية recombinase نشطة للخلايا ، ومع ذلك ، يمثل القيد.
نحن تصف نظام النواقل pSESAME ، الذي يسمح للالإدراج المباشر من الجينات من الفائدة ويوفر منبرا لاستنساخ بسرعة مختلف المجالات والعلامات المستخدمة داخل ناقلات بطريقة مريحة وموحدة. إعادة ترتيب من علامات مختلفة وقد تبين لتعديل خصائص البيوكيميائية من البروتينات الانصهار توفير إمكانية تحقيق عائدات أعلى وأفضل للذوبان. نحن لشرح كيفية التعبير عن المؤتلف وتنقية الخلايا والبروتينات في نفيذ من كولاي. التحقق من صحة أخيرا وظيفة البروتين المؤتلف لجنة المساواة العرقية في ثقافة الخلية من خلال تقييم نشاطها recombinase داخل الخلايا.
Protocol
Discussion
أثناء عملية تنقية البروتين الانصهار لجنة المساواة العرقية من المهم عدم تجاهل إضافة العازلة TBS الجليد الباردة قبل الطرد المركزي. خلاف لجنة المساواة العرقية recombinase يميل إلى ترسيب داخل المنطقة العازلة الجلسرين.
وينبغي إذا الكسر شطافة يبدو أن تصبح تضاف عكر نظرا لتركيز عال من البروتين العازلة الانصهار شطف إضافية حتى هذا الحل قد مسح مرة أخرى.
الطلب من 10 ميكرومتر من البروتين الانصهار لجنة المساواة العرقية النتائج عادة في كفاءة تأشب من 80 إلى 100 ٪. الجنين مصل العجل (FCS) كونه عنصرا رئيسيا من عناصر الخلية المتوسطة ES بقوة تنبيغ يثبط البروتين. وكان تركيز عال من ذلك recombinase لجنة المساواة العرقية لاستخدامه. عند العمل في ظروف خالية من المصل أقل من البروتين (0.5 — 2 ميكرومتر) يمكن استخدامها لتحقيق الكفاءة تأشب مماثلة.
مع نظام ناقل pSESAME في متناول اليد ويمكن للمرء أن يطبق تقنية تنبيغ البروتين لبروتينات أخرى بما في ذلك عوامل مثل النسخ وOct4 Sox2 7 و 8 Scl/Tal1.
Acknowledgements
نشكر أوليفر Brüstle وجميع أعضاء المجموعة الهندسية الخلايا الجذعية في جامعة بون ، للحصول على الدعم والمناقشات القيمة. نشكر سابين شينك لإعداد SDS – PAGE ودعم دائم في جميع أنحاء المشروع. وقدمت نيكول روس Magerhans آنا الدعم الفني الممتاز. وعلاوة على ذلك ، نود أن نشكر المحامين وأندرياس ميرتنز شيلا لإنتاج الفيلم. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة فولكسفاغن (از I/77864) والوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث (BMBF ، 01 GN 0813).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| TUNER (DE3) pLacI | Novagen | 70625 | ||
| Glycerol | Carl Roth | 3783.2 | ||
| Na2HPO4 | Roth | T876.1 | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | ||
| HCl | Roth | 4625.1 | ||
| Imidazol | Roth | X998.4 | ||
| NaCl | Roth | 9265.2 | ||
| Yeast Extract | Roth | 2363.4 | ||
| Trypton/Pepton | Roth | 8952.4 | ||
| K2HPO4 | Roth | P749.2 | ||
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | ||
| Ampicillin | Sigma | A9518 | ||
| Carbenicillin | Sigma | 6344.2 | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | ||
| Lysozyme | Sigma | 62971 | ||
| Benzonase | Novagen | |||
| L-Tartaric acid, disodium salt | Sigma | |||
| 50% Ni-NTA slurry | Invitrogen | R901-15 | ||
| EconoPac columns | Biorad | 732-1010 | ||
| Sterile filter 0,22μm | Whatman | |||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | |||
| LB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl | |||
| TB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4 | |||
| Lysis Buffer | 50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8 | |||
| Tartaric Salt Buffer (TSB) | PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol | |||
| Washing Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol | |||
| Elution Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol | |||
| High Salt Buffer | 600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | |||
| Gylcerol Buffer | 50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | |||
| TrypLE™ Express | Invitrogen | |||
| ESGRO (LIF) | Millipore | |||
| NEAA | Gibco | 11140035 | ||
| L-Glutamin | Gibco | 25030024 | ||
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | ||
| DMEM | Gibco | 11960044 | ||
| PBS | Gibco | |||
| Fetal Calf Serum (FCS) | PAA | |||
| X-Gal staining solution: | 4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS |
|||
| K3(FeIII(CN)6) | Sigma | P-3367 | ||
| K4 (FeII(CN)6) | Sigma | P-9387 | ||
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ||
| X-Gal | Sigma | B4252 |
References
- Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).
- Edenhofer, F. Protein transduction revisited: novel insights into the mechanism underlying intracellular delivery of proteins. Curr Pharm Des. 14 (34), 3628-3636 (2008).
- Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. Dev Cell. 6 (1), 7-28 (2004).
- Nolden, L. Site-specific recombination in human embryonic stem cells induced by cell-permeant Cre recombinase. Nat Methods. 3 (6), 461-467 (2006).
- Zhang, Y. Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 24 (4), 543-548 (1996).
- Peitz, M. Enhanced purification of cell-permeant Cre and germline transmission after transduction into mouse embryonic stem cells. Genesis. 45 (8), 508-517 (2007).
- Bosnali, M., Edenhofer, F. Generation of transducible versions of transcription factors Oct4 and Sox2. Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).
- Landry, J. R. Runx genes are direct targets of Scl/Tal1 in the yolk sac and fetal liver. Blood. 111 (6), 3005-3014 (2008).
