Представлен протокол картирования трехмерной организации генома с нуклеосомным разрешением с использованием метода полногеномного захвата конформации хромосом Micro-C-XL.
Трехмерная (3D) организация хромосом является основным фактором регуляции генома и спецификации типа клетки. Например, считается, что цис-регуляторные элементы, известные как энхансеры, регулируют активность дистальных промоторов посредством взаимодействия в трехмерном пространстве. Полногеномные технологии захвата конформации хромосом (3C), такие как Hi-C, изменили наше понимание того, как геномы организованы в клетках. Современное понимание трехмерной организации генома ограничено разрешением, с которым может быть решена топологическая организация хромосом в трехмерном пространстве. Micro-C-XL измеряет сворачивание хромосом с разрешением на уровне нуклеосомы, основной единицы хроматина, используя микрококковую нуклеазу (МНазу) для фрагментации геномов во время протокола захвата конформации хромосом. Это приводит к улучшению соотношения сигнал/шум в измерениях, что способствует лучшему обнаружению участков изоляции и хромосомных петель по сравнению с другими полногеномными 3D-технологиями. В данной статье представлен наглядно подтвержденный, подробный, пошаговый протокол подготовки высококачественных образцов Micro-C-XL из клеток млекопитающих.
Micro-C-XL — это полногеномный метод измерения 3D-конформации генома с нуклеосомным разрешением. Micro-C-XL основан на широко используемой технологии Hi-C, основанной на бесконтактном лигировании, которая изменила нашепонимание того, как организованы 3D-геномы. Micro-C-XL и его первая итерация, Micro-C, были первоначально разработаны в Saccharomyces cerevisiae2,3, а затем адаптированы к клеточным системам млекопитающих, для которых протокол продемонстрировал весь свой потенциал в обнаружении ближних особенностей 3D-генома, таких как хромосомные петли и сайты изоляции. Эта версия основана на недавних публикациях Micro-C-XL у млекопитающих 4,5. Поскольку Micro-C-XL заменяет Micro-C, Micro-C-XL в дальнейшем упоминается в рукописи как Micro-C.
Основные различия между Micro-C и Hi-C6 заключаются в следующем: 1) фрагментация генома микрококковой нуклеазой (MNase) по сравнению с ферментами рестрикции и 2) дополнительные сшивающие агенты с большим расстоянием между атомами между реактивными группами по сравнению только с формальдегидом. Оба этапа вносят значительный вклад в улучшение соотношения сигнал/шум Micro-C по сравнению с обычным Hi-C. Размер фрагментации ограничивает разрешение, до которого может быть разрешена 3D-организация генома во время протокола бесконтактного лигирования. MNase — это нуклеозаза, которая преимущественно переваривает доступную ДНК и оставляет нуклеосомно-защищенную ДНК нетронутой. Нуклеосомный след с использованием MNase-секвенирования показал, что нуклеосомы полностью покрывают большинство эукариотических геномов7. Поскольку нуклеосомы распределены по всему геному со средним интервалом 160-220.н., в зависимости от вида и типа клеток, MNase является идеальным ферментом для картирования архитектуры генома с высоким разрешением.
Использование дополнительного сшивающего агента в сочетании с формальдегидом (ФА) в методе Micro-C дополнительно улучшает отношение сигнал/шум 2,8. Аминоспецифичные сшивающие агенты с более длинными атомными спейсерами между реакционноспособными группами облегчают белок-белковые сшивания. Обычно это дисукцинимидилглутарат (DSG) или бис-сукцинимидилсукцинат этиленгликоля (EGS) с разделками 7,7 Å и 16,1 Å соответственно. Снижение шума с помощью EGS или DSG особенно очевидно в экспериментах с высокой скоростью фрагментации, таких как Micro-C, и, по-видимому, происходит из-за снижения частоты случайных событий лигирования8.
Недавно разработанный протокол Hi-C 3.0, использующий кросслинкинг ESG/DSG и множественные комбинации ферментов рестрикции, снижает шум в экспериментах с Hi-C и значительно улучшает обнаружение хромосомных петель и участков изоляции 8,9. Тем не менее, пошаговое сравнение различных характеристик данных взаимодействия показало, что Micro-C обладает превосходным обнаружением ближних объектов, таких как хромосомные петли и сайты изоляции, по сравнению как с Hi-C 3.0, так и с обычным Hi-C8. Тем не менее, Hi-C 3.0 действительно улучшает обнаружение объектов на близком расстоянии и поддерживает сильное обнаружение компартментализации генома по сравнению с обычным Hi-C. Таким образом, выбор метода захвата конформации хромосом должен определяться объективным и биологическим вопросом.
Здесь мы приводим пошаговый протокол для успешных экспериментов на Micro-C, которые могут разгадать организацию 3D-генома.
Успех эксперимента на Micro-C зависит от нескольких критических шагов в протоколе, которые необходимо тщательно выполнить. Во-первых, сшивание с помощью дополнительного сшивающего агента DSG или EGS может привести к агрегации ячеек, в зависимости от типа ячейки. Добавление 0,1%-0,5% БСА в реакцию сшивания значительно снижает агрегацию, не влияя на эффективность сшивания. Неэффективное сшивание может привести к увеличению частоты трансхромосомных взаимодействий, которые указывают на случайные лигирования. Вторым, но самым важным этапом в этом протоколе является расщепление хроматина с помощью MNase. Неоптимальное расщепление хроматина приводит к неэффективному бесконтактному лигированию (избыточное переваривание) или увеличению скорости неблизко лигированных динуклеосом (недоваривание). Эффективность реакции лигирования может быть оценена с помощью электрофореза в агарозном геле (рис. 1B) и дополнительно лучше всего оценивается с помощью секвенирования с низким входом. Если секвенирование с низким входом обнаруживает либо высокую скорость дупликации (неэффективное лигирование), либо повышенную скорость динуклеосом, степень расщепления МНазы следует переоценить. Примечательно, что потеря выборки при выполнении протокола может привести к снижению сложности библиотеки. Концентрацию образца лучше всего оценивать после очистки ДНК (шаг 5.3) или с помощью минимальной ПЦР (шаг 8). Общий выход ДНК из клеток 5 x 106 млекопитающих после очистки ДНК обычно составляет >2 мкг. Концентрацию ДНК следует контролировать после расщепления MNase, расщепления ExoIII и очистки ДНК. Источником деградации ДНК могут быть эндогенные нуклеазы, обилие которых специфично для типа клетки и вида. Кроме того, колоночная очистка ДНК может привести к потере образца из-за несовместимости с SDS из реакций депротеинирования. Осаждение этанола можно рассматривать, если концентрация ДНК на этом этапе низкая.
Поскольку Micro-C требует титрования MNase для конкретного образца, применять Micro-C к небольшим клеточным популяциям, например, к небольшим органам различных модельных организмов, эмбрионов и отдельных клеток, органоидов или биоптатов пациентов, сложно. Здесь Hi-C 3.0 предлагает хорошо зарекомендовавшую себя альтернативу, использующую конечную реакцию последовательно-специфичными эндонуклеазами рестрикции 8,9.
Micro-C — это широко применяемая технология конформации хромосом высокого разрешения с широким динамическим диапазоном и низким отношением сигнал/шум, что делает ее особенно подходящей для исследования хромосомных особенностей малого радиуса действия 4,5,8, таких как хромосомные петли. Разрешение Micro-C позволяет захватывать петли промотор-энхансер, которые находятся за пределами предела обнаружения Hi-C, что позволяет проводить более детальный анализ взаимосвязи между организацией генома и регуляцией13,14,15. Кроме того, стратегии захвата ДНК недавно были объединены с Micro-C, чтобы увеличить локус-специфичное разрешение целевых геномных локусов до беспрецедентного уровня, что позволило по-новому взглянуть на ультраструктуру 3D-генома16,17,18. Таким образом, мы предполагаем, что Micro-C и его производные станут ключевой технологией для препарирования роли 3D-генома в транскрипционной регуляции и, следовательно, дифференцировке и поддержании типа клеток.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Кристл Гаубиц и Кэтлин Стюарт-Морган за критическое прочтение рукописи. Мы благодарим Аню Грот и лабораторию Грота за их поддержку в создании нашей лаборатории. Благодарим за поддержку сотрудников платформы CPR/reNEW Genomics: Х. Волльманна, М. Мишо и А. Калвису. Центр медицины стволовых клеток Фонда «Ново Нордиск» (reNEW) поддерживается грантом No NNF21CC0073729 Фонда «Ново Нордиск». Центр исследований белка (CPR) Фонда «Ново Нордиск» поддерживается грантом No NNF14CC0001 Фонда «Ново Нордиск». Мы благодарим лабораторию Брикмана в Центре медицины стволовых клеток Novo Nordisk, reNEW Copenhagen, за ES клетки мышей.
1 mM Biotin dATP | Jenna Bioscience | NU-835-Bio14-S | |
1 mM Biotin dCTP | Jenna Bioscience | NU-809-BioX-S | |
10 mM dGTP | NEB | N0442S | |
10 mM dTTP | NEB | N0443S | |
10 U/ml T4 PNK | NEB | M0201L | |
100 U/L Exonuclease III | NEB | M0206L | |
10x NEBuffer 1.1 | NEB | B7001S | |
10x NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | |
10x T4 DNA Ligase buffer | NEB | B0202A | |
1x DPBS w/o Mg2+ and Ca2+ | ThermoFisher | 14190144 | |
1x LIF | |||
2_Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | 0.1 mM b-mercaptoethanol |
37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-500ML | Caution. See manufactures MSDS |
400 U/ml T4 DNA Ligase | NEB | M0202L | |
5 U/ml Klenow Fragment | NEB | M0210L | |
Agarose | BIO-RAD | 1613102 | Caution. See manufactures MSDS |
BSA 20mg/ml | NEB | B9000S | |
CaCl2 | |||
cell counter | |||
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D8418-100ML | Caution. See manufactures MSDS |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | refered to as: magnet magnet for 1.5 ml tubes |
DynaMag-PCR Magnet | Invitrogen | 492025 | refered to as: magnet magnet for PCR tubes |
EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | BioWorld | 40121266-1 | |
Ethanol 96% | VWR Chemicals | 20824365 | quality control system |
Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | |
Ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS) | ThermoFisher | 21565 | |
Fetl Bovin Serum | Sigma Aldrich | F7524 | 15% FBS |
Gel Loading dye purple (6X) | NEB | B7024S | |
Glycine | PanReac AppliChem | A1067.0500 | |
Halt Proteinase inhibitor (100x) | ThermoFisher | 78430 | Caution. See manufactures MSDS |
IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | 18896-50ML | |
MgCl 1 M | Invitrogen | AM9530G | |
Micrococcal Nuclease (MNase) | Worthington | LS004798 | |
mouse embryonic stem cells | |||
NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index primers) | NEB | E7600S | amplification primers for sequencing libraries |
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | NEB | E7645L | sequencing library preparation kit |
NEBNext Ultra II Q5 Master mix | NEB | M0544S | Caution. See manufactures MSDS |
Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | 1x NEAA |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | 1% Pen-Strep |
Proteinase K (40 mg/ml) | GoldBio | P-480-1 | Caution. See manufactures MSDS |
QIAquick Gel extraction kit | QIAgen | 28706 | refered to as: DNA gel elution kit |
QIAquick PCR purification kit | QIAgen | 28106 | refered to as: commercial DNA purification kit |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA quantification instrument |
Quick load purple 1kb plus DNA Ladder | NEB | N0550S | |
SPRIselect size selection beads | Beckman Coulter | B23319 | paramagnetic beads |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | refered to as: thermomixer |
Tris | Merck | 10708976001 | |
Trypsin | |||
Tween20 | Sigma Aldrich | P7949-100ML | |
Ultrapure 10% SDS | Invitrogen | 15553-035 | |
Ultrapure Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol (PCI) | Invitrogen | 15593-031 | |
Fragment Analyzer |