Micro-C-XLによる哺乳類3Dゲノム相互作用のマッピング

1. 細胞培養と架橋 実験による培養細胞は、最低1×107細胞を得る必要がある。ここで、細胞をE14培地(ピルビン酸およびL-グルタミンを含むDMEM、15S、1x LIF、1x NEAA、1%ペンストレプ、0.1 mM β-メルカプトエタノール[材料表参照])中で5%CO2で37°Cで増殖させ、2日おきに継代しました。注:このプロトコルは多数の種からのさまざまなセルタイプに首尾よく、 Homo sapiensおよび Musのmusculusのような適用された。この例では、マウス胚性幹細胞(ES)を使用しました。 培地を吸引することにより、70%〜80%のコンフルエントで細胞を回収します。5 mLのDPBSで1回洗浄し、37°Cで2〜3分間、10 cmディッシュあたり3 mLの予熱した0.25%トリプシンで細胞をインキュベートします。 トリプシンを7 mLの予熱したE14培地でクエンチし、剥離した細胞を50 mLのチューブに移します。 室温(RT)で5分間、300 x g で遠心分離することにより、細胞をペレット化します。上清を捨て、細胞ペレットを培地に再懸濁します。セルカウンターでセルをカウントします。注 プロトコルは細胞の集中のばらつきに対して強く、さまざまな細胞カウンターが細胞数を量量化するのに使用された;ただし、使用するセルカウンタのダイナミックレンジに注意してください。これは通常、1 x 105-1 x 107 cells/mLです。この細胞タイプでは遠心分離の速度と時間がテストされていますが、異なる小さな細胞では、より高い遠心分離速度またはより長いスピン時間が必要になる場合があり、それに応じて遠心分離を調整する必要があります。 300 x g で5分間の遠心分離により細胞を室温で回収し、最終濃度1 x 106 cells/mLで細胞をDPBSに再懸濁します。例えば、収量が1 x 107 細胞の場合、10 mLのDPBSに細胞を再懸濁します。 最初の架橋工程では、37%ホルムアルデヒド(FA)を最終濃度1%になるように細胞懸濁液に添加し、細胞懸濁液を回転(15〜20rpm)しながら室温で10分間インキュベートします。例として、収量が1 x 107 細胞の場合、10 mLの細胞懸濁液に270 μLのFAを添加します。注意: FA溶液は、通常、開封後最大3か月間RTで安定しています。 2.5 Mグリシンを最終濃度0.25 Mに添加して反応をクエンチし、回転(15〜20 rpm)しながら室温で5分間インキュベートします。例えば、収量が1 x 107 細胞の場合、1.027 mLの2.5 Mグリシンを細胞懸濁液に添加します。 室温で300 x g で5分間遠心分離して細胞を回収し、上清を廃棄し、細胞を5 mLのDPBSに再懸濁します。遠心分離ステップを1回繰り返し、ペレット化した細胞をDPBSに4 x 106 細胞/mLに再懸濁します。例えば、収量が1 x 107 細胞の場合、細胞を2.5 mLのDPBSに再懸濁します。 2 番目の架橋ステップでは、エチレングリコールビス-スクシンイミジルサハク酸(EGS)の 0.3 M ストック溶液を DMSO 中に調製します(100 μL の DMSO 中に 13.6 mg の EGS)。最終濃度3 mMのEGSを細胞懸濁液に添加し、室温で40分間回転(15〜20 rpm)インキュベートします。例えば、収量が1 x 107 細胞の場合、25 μLの0.3 M EGSストック溶液を2.5 mLの細胞懸濁液に加えます。注:ストック溶液を調製するために計量する前に、EGSをRTに少なくとも20分間平衡化します。 2.5 Mグリシンを最終濃度0.4 Mに添加して反応をクエンチし、回転(15-20 rpm)しながら室温で5分間インキュベートします。例えば、収量が1 x 107 細胞の場合、400 μLの2.5 Mグリシンを細胞懸濁液に加えます。 室温で1,000 x gで5分間遠心分離して細胞を回収し、ペレット化した細胞をDPBSで5 x 106 cells/mLに再懸濁します。分取ライブラリー用に 5 x 10 6 cells/tube、MNase 消化用の滴定用に 1 x 106 cells/tube を分配します。注:架橋された細胞バッチごとに最適な消化度を滴定することをお勧めします。理想的には、MNase滴定実験(ステップ2)では1 x 10 6細胞のアリコートを2〜3個、分取実験(ステップ3)では5 x 106細胞のアリコートを2〜4個採取します。 室温で1,000 x g で5分間遠心分離して細胞を回収し、上清を除去します。細胞ペレットを液体窒素中で急速凍結し、-80°Cで保存します。注:正常なMicro-Cライブラリは、最大3か月間保存されたサンプルから調製できます。 2. MNase滴定 注:二重架橋細胞の分取ライブラリーを処理する前に、MNaseの最適濃度を決定するために、MNase滴定を実施する必要があります。 MNase滴定を行うには、1 x 106 細胞のペレット1個を氷上で10分間融解し、細胞を500 μLのDPBSに再懸濁します(細胞が壁に付着している場合は1x BSAを添加します)。細胞懸濁液を氷上で20分間インキュベートします。 室温で10,000 x gで5分間遠心分離して細胞を回収し、上清を除去します。ペレット化した細胞を500 μLのMB#1バッファー(50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、5 mM MgCl 2、1 mM CaCl 2、0.2% NP-40、1xプロテアーゼ阻害剤[材料表を参照]、pH 7.4)に再懸濁します。 10,000 x g で5分間遠心分離して細胞を回収し、上清を除去します。細胞を200 μLのMB#1バッファーに再懸濁し、サンプルを4本のチューブに分割します。 MNase バイアル 1 本(20 U/μL)を融解し、10 mM トリス(pH 7.4)で 1:2、1:4、1:4、1:4 に希釈して、それぞれ 10 U/μL、2.5 U/μL、0.625 U/μL、0.1256 U/μL(消化条件ごとに 1 つ)の濃度にします。適切な時間間隔(10〜20秒)で、1 μLのMNase溶液を4つのサンプルの1つに添加し、ボルテックスし、サーモミキサーで37°Cで10分間(800rpm振とう)インキュベートします。残りの MNase 希釈液から 1 μL を残りの細胞アリコートに添加します。 新たに調製したSTOPバッファー200 μL(150 μLの10 mM Tris、pH 7.4、25 μLの10 % SDS、25 μLの20 mg/mLプロテイナーゼK、2 μLの0.5 M EGTA)を、MNaseを添加したのと同じ順序で同じ時間間隔で各チューブに添加して、Mnase消化を停止します。65°Cで2時間インキュベートします。 各サンプルに500 μLのフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール(PCI)を加え、ボルテックスで完全に混合します。室温で 19,800 x g で 5 分間遠心分離して相を分離し、水相を新しいチューブ(約 200 μL/サンプル)に移します。注意: PCIには多数の有毒成分が含まれているため、化学物質の安全フードでのみ取り扱ってください。詳しくはメーカーにご相談ください。 メーカーの指示に従って市販のDNA精製キット( 材料表を参照)を使用してDNAを精製し、12 μLの溶出バッファーにサンプルを溶出します。注:脱タンパク質化ステップ(ステップ2.5)のSDS濃度は、一部のDNA精製キットでは阻害的です。ここで使用するDNA精製キットは、エタノール沈殿と同等の性能を発揮します。 2〜5μLのローディング色素を加え、1.5%アガロースゲル上で120Vで30〜50分間(適切に分離されるまで; 図1A)。 実験に最適な消化度を選択し、分取 MNase 消化を続行します。最適な消化度は、サブヌクレオソーム断片がほとんどまたはまったくなく、モノヌクレオソームとジヌクレオソームの比率が70%〜90%です。注:この実験では、図1Aのレーン4の消化度は、2.5 x 10 5細胞に対して0.625-1.25 UのMnase(= 1 x 106細胞に対して2.5-5 UのMnase)で得られた最適な消化であると判断されました。詳細な議論については、代表的な結果を参照してください。 3. 分取 MNase 消化 MNase 消化 によって クロマチンをモノヌクレオソームにフラグメント化するには、以前にダブルクロスリンクした 5 x 106 セルアリコートを解凍し、1 mL の DPBS に再懸濁します。氷上で20分間インキュベートします(細胞がチューブ壁に付着する場合は、1x BSAを追加します)。 室温で10,000 x g で5分間遠心分離して細胞を回収し、上清を廃棄します。ペレットを500 μLのMB#1バッファーに再懸濁します。遠心分離ステップを1回繰り返します。ペレットを 1 mL の MB#1 バッファーに再懸濁し、200 μL のアリコート(アリコートあたり 1 x 106 細胞)を作ります。 MNase滴定(ステップ2で説明)に基づいて、各アリコートに適切な量のMNase(通常、1 x 106 細胞あたり2.5-10 U/μL)を添加してクロマチンを消化します。よく混合し(ボルテックスして素早く回転させ)、サーモミキサーで37°Cで10分間、800rpmの振とうでインキュベートします。 各アリコートに 1.6 μL の 0.5 M EGTA (最終 4 mM) を加えて MNase 消化を停止し、サーモミキサーで 65 °C で 10 分間、800 rpm 振とうしながらインキュベートします。 室温で10,000 x g で5分間遠心分離してサンプルを回収し、上清を廃棄します。細胞ペレットを500 μLの1x NEBuffer 2.1に再懸濁します。 5 x 106 セル以下の入力に相当するサンプルをプールして、さらに処理します。注:5 x 10 6 細胞以上を処理する場合は、酵素条件が 5 x 106 細胞に最適化されているため、これらのサンプルを並行して処理してください。 近接ライゲーションステップに進む前に、サンプルの 10% をインプットコントロールとして移し、MNase 消化レベルをコントロールします。150 μLの10 mM Tris(pH 7.4)、25 μLの10% SDS、25 μLの20 mg/mLプロテイナーゼKをこのサンプルに加え、65°Cで一晩インキュベートします。 4. DNA末端プロセシングと近接ライゲーション 残りのサンプルを10,000 x g で4°Cで5分間遠心分離して回収し、上清を廃棄します。ペレットを新たに調製したMicro-Cマスターミックス1(表1)90 μLに再懸濁し、サーモミキサーで37°C、800rpmの振とうで15分間インキュベートします。 10 μL の 5 U/μL Klenow Fragment を添加し、サーモミキサー上で 37 °C で 15 分間、800 rpm の振とうでインキュベートします。 調製したばかりのMicro-Cマスターミックス2(表2)100 μLを加え、サーモミキサーで25°C、800rpmの振とうで45分間インキュベートします。インキュベーション後、EDTAを最終濃度30 mMに添加して酵素反応をクエンチします。サーモミキサーで65°C、800rpmの振とうで20分間インキュベートします。 4°Cで10,000 x g で5分間遠心分離してサンプルを回収し、上清を廃棄します。サンプルを新たに調製したMicro-Cマスターミックス3(表3)500 μLに再懸濁し、回転(15〜20 rpm)しながら室温で2.5時間インキュベートします。 4°Cで10,000 x g で5分間遠心分離してサンプルを回収し、上清を廃棄します。サンプルを新たに調製した Micro-C マスターミックス 4 200 μL (表 4) に再懸濁し、サーモミキサーで 37 °C で 15 分間、800 rpm の振とうでインキュベートします。 逆架橋および脱タンパク質化の場合は、25 μL の 20 mg/mL プロテイナーゼ K と 25 μL の 10% SDS をサンプルに加え、間欠混合しながら 65 °C で一晩インキュベートします。 5. ジヌクレオソームDNAの精製とサイズ選択 500 μL の PCI をサンプルとインプットコントロールに添加し、ボルテックスで混合します。19,800 x g で 5 分間遠心分離して相を分離し、上部の水相を新しいチューブに移します。 DNA精製キットを使用するか、エタノール沈殿によってDNAを濃縮します。サンプルを 30 μL に溶出し(ステップ 5.3)、インプットコントロールに溶出(ステップ 3.11)を 15 μL に溶出し、1.5 % アガロースゲルを泳動させてモノヌクレオソームとジヌクレオソームを分離します(図 1B)。注:脱蛋白ステップからのSDS濃度は、一部のDNA精製キットでは阻害的です。ここで使用したDNA精製キット( 材料表を参照)は、エタノール沈殿と同等の性能を発揮します。使用する細胞の数に応じて、インプットは100 ngから10 μgの範囲になります。典型的には、5 x 106 細胞から1〜5μgのDNAが抽出される。 ジヌクレオソームサイズ(約300 bp)のDNA断片を切除します。市販のDNAゲル溶出キット( 材料表参照)を使用して、アガロースゲルからDNAを抽出し、150μLで溶出します。 6. ストレプトアビジンビーズの調製 サンプルあたり10 μLのストレプトアビジンビーズ( 材料表を参照)を反応チューブに移します。 1.5 mLチューブ用の適切な磁石に入れます( 材料表を参照)。溶液が透明になったら(1〜2分)、上清を除去し、サンプルあたり300 μLの1x TBW(5 mM Tris-HCl、pH 7.5、0.5 mM EDTA、1 M NaCl、0.05% Tween 20)にビーズを再懸濁します。この手順を 1 回繰り返します。 ステップ7で処理したサンプル1個あたり、150 μLの2x B&Wバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 7.5、1 mM EDTA、2 M NaCl)にビーズを再懸濁します。 7. ストレプトアビジンプルダウンおよびオンビーズライブラリーの調製 150 μLのサンプル(ステップ5.3)に150 μLの調製済みビーズを加えます(ステップ5.3)。回転(15〜20 rpm)で室温で20分間インキュベートします。 チューブを適切な磁石に入れ、溶液が透明になるまで待ちます(1〜2分)。上清を除去し、ビーズを300 μLの1x TBWに再懸濁します。この手順を繰り返します。 チューブを適切な磁石に入れ、溶液が透明になるまで待ちます(1〜2分)。上清を除去し、ビーズを 100 μL の 0.1x TE(1 mM Tris、0.1 mM EDTA、pH 8.0)に再懸濁します。 チューブを適切な磁石に入れ、溶液が透明になるまで待ちます(1〜2分)。上清を除去し、ビーズを 50 μL の 0.1x TE に再懸濁し、PCR チューブに移します。注:使用した0.1x TEの容量(50 μL)は、このプロトコルで使用されるDNAシーケンシングライブラリ調製キット( 材料表を参照)のインプット容量に対応します。別のキットまたはストラテジーを使用する場合は、それに応じて音量を調整してください。 シーケンシングライブラリ調製キットのDNA操作ステップを、メーカーのプロトコルに従って実行します。これらのステップには、通常、DNAブラント、Aテーリング、アダプターライゲーション、およびU切除が含まれます。最後のステップ(U切除)は、この研究で使用したキットに固有です。そのキットを使用する場合は、希釈されていないアダプターを使用して、キットプロトコルのステップ1からステップ2.6までの製造元の指示に従い、ステップ2.6以降は-20°Cの保管を考慮しないでください。注:シーケンシングキットに必要なバッファー交換は、DNAがまだストレプトアビジンビーズに結合しているため、ビーズを磁石に結合させて洗浄(ステップ7.3〜7.4)することによって交換する必要があります。さらに、DNAは磁気ビーズに結合しているため、キットプロトコルのアダプターライゲーション後の精製およびサイズ選択のステップは無視してください。ステップ 7.6 (このプロトコル) に進みます。 アダプターのライゲーションが完了したら、ステップ7.2の説明に従ってサンプルを洗浄します。上清を廃棄し、ビーズを 20 μL の 0.1x TE に再懸濁します。 8. 必要なPCRサイクルの推定 注:ライブラリ増幅に必要なPCRサイクルを推定することをお勧めします。通常、Micro-Cライブラリには8〜15サイクルのPCRが必要です。このステップは必須ではありませんが、過剰増幅を回避し、PCR重複のリスクを低減するのに役立ちます。 必要な最小PCRサイクル数を定義するには、1 μLのストレプトアビジン-ビオチン-DNAサンプルでPCRを実施します(ステップ7.6)。これを行うには、PCRマスターミックス(3.2 μLのH2O、0.4 μLのi5プライマー、0.4 μLのi7プライマー、および5 μLのQ5ハイフィデリティDNAポリメラーゼ)をサンプルに加えます。使用するDNAライブラリ調製キットの製造元の指示に従って、16サイクルでPCRを実施します。注:ここで使用するプライマーは、使用するライブラリ調製キットと互換性がある必要がある別のキット( 材料表を参照)で購入します。 PCR後、適当な磁石でビーズを採取し、高感度DNA定量装置( 材料表参照)を用いて上清1μLのDNA濃度を測定します。総DNA濃度を得るには、この値に10(PCR反応の総量)を掛けます。代表的な結果で説明されているように、必要なPCRサイクル数を推定します。 残りの9 μLのPCR混合物に2 μLの6xローディングバッファーを加えます。PCR 増幅ライブラリを 1% アガロースゲルで分離し、アダプターライゲーションが成功したと判断すると、サイズは約 450 bp になります(図 1C)。注:ゲルは、約 420 bp の明確なバンドを示す必要があります(Micro-C ライブラリとアダプター)。120 bp のバンドはアダプターの二量体を表し、複雑度の低いライブラリを示します。低分子量のバンド(100 bp未満)が現れることがありますが、これらはPCR反応からの未使用のプライマーです。 9. シーケンシングライブラリ増幅 ストレプトアビジン-ビオチン-DNAサンプルの残りの19 μLにPCRマスターミックス(65 μLのH2O、100 μLのQ5ハイフィデリティDNAポリメラーゼ、8 μLのi5プライマー、8 μLのi7プライマー)を加えます。反応混合物を50〜100μLのアリコートに分割します。注:PCRの最適な容量は、PCRマシンによって異なります。通常、50 μLは、一般的なPCRマシンで最も再現性の高い増幅を提供します。 DNAライブラリ調製キットの製造元の指示に従い、ステップ8で決定したサイクル数でPCRを実施します。ステップ8を省略した場合、PCRには14サイクルが推奨されます。 常磁性ビーズ( 材料表を参照)で、メーカーのプロトコルに従って1:0.9の比率でDNAを精製します。20 μL の 0.1% TE に溶出します。注意: ステップ8.5でアダプターダイマーが検出された場合は、同じ比率で精製を2回行ってください。 DNA濃度を測定し、品質管理システムでサンプルを実行します( 材料表を参照)。Micro-Cライブラリの品質は、単一の正確なバンドが存在することで確保します(図1D)。注:アダプター二量体は、PCRの前にサンプルを洗浄するため、オンビーズライブラリ調製では一般的ではありません。したがって、アダプターダイマーの出現は、ライブラリの複雑さが低いことを示しています。アダプターダイマーが観察された場合は、低インプットシーケンシングでサンプルを品質管理することを強くお勧めします。 10. DNAシーケンシングとデータ処理 シーケンシングプロバイダーの要件に従って、ペアエンドシーケンシングでMicro-Cライブラリをシーケンシングします。注:理想的には、サンプルはプラットフォーム上でペアエンドモードで、リードあたり 50 bp でシーケンシングされます。2 x 35 bpなど、読み取り長が短い古いプラットフォームもうまく使用されています。重要なことは、反復ゲノム領域を研究する場合は、より長いリード長で配列決定することが望ましい場合があるということです。 Micro-C ライブラリの品質を評価するには、サンプルあたり 5 x 106 から 1 x 107 リードの低入力シーケンシングを実行します。 シーケンシングファイル(fastqファイル)をDistiller10で処理します。リードを適切な参照ゲノム(ここではmm10)にマッピングします。注: シーケンス ファイルは、ローカル コンピューターまたはコンピューティング クラスター上のさまざまなパイプラインを使用して処理できます。シーケンシング深度が浅いサンプルの場合、10,000 bp、50,000 bp、100,000 bp、500,000 bp などの大きなビンサイズにより、計算量とファイルサイズを削減できます。Distiller(この調査で使用)は、Micro-Cライブラリの品質を評価するために必要なすべてのファイルタイプを生成します。生成された *.stats ファイルには、マップレート、シストランス比、および読み取りペア間の距離によって層別化された読み取り方向に関する情報が含まれています。これらのパラメータを 図2に示し、代表的な結果でMicro-Cライブラリの品質評価について説明します。また、処理ソフトウェアは、相互作用行列を生成するためにHiGlass(https://docs.higlass.io/)に直接ロードできるmcoolファイルも生成する9。