3D-genoominteracties van zoogdieren in kaart brengen met Micro-C-XL
Summary
Een protocol voor het in kaart brengen van de driedimensionale genoomorganisatie met nucleosoomresolutie met behulp van de genoomwijde chromosoomconformatie-capture-methode Micro-C-XL wordt hier gepresenteerd.
Abstract
Driedimensionale (3D) chromosoomorganisatie is een belangrijke factor in genoomregulatie en celtypespecificatie. Er wordt bijvoorbeeld gedacht dat cis-regulerende elementen, bekend als enhancers, de activiteit van distale promotors reguleren via interactie in de 3D-ruimte. Genoomwijde chromosoomconformatie capture (3C)-technologieën, zoals Hi-C, hebben ons begrip van hoe genomen in cellen zijn georganiseerd getransformeerd. Het huidige begrip van de organisatie van het 3D-genoom wordt beperkt door de resolutie waarmee de topologische organisatie van chromosomen in de 3D-ruimte kan worden opgelost. Micro-C-XL meet chromosoomvouwing met resolutie op het niveau van het nucleosoom, de basiseenheid van chromatine, door gebruik te maken van microkokkennuclease (MNase) om genomen te fragmenteren tijdens het protocol voor het vastleggen van chromosoomconformatie. Dit resulteert in een verbeterde signaal-ruisverhouding in de metingen, waardoor de detectie van isolatieplaatsen en chromosoomlussen beter kan worden gedetecteerd in vergelijking met andere genoombrede 3D-technologieën. In dit artikel wordt een visueel ondersteund, gedetailleerd, stapsgewijs protocol gepresenteerd voor het bereiden van hoogwaardige Micro-C-XL-monsters uit zoogdiercellen.
Introduction
Micro-C-XL is een genoombrede techniek om 3D-genoomconformatie te meten met nucleosoomresolutie. Micro-C-XL bouwt voort op de veelgebruikte Hi-C-technologie op basis van nabijheidsligatie, die ons begrip van hoe 3D-genomen zijn georganiseerd heeftveranderd1. Micro-C-XL en zijn eerste iteratie, Micro-C, werden aanvankelijk ontwikkeld in Saccharomyces cerevisiae2,3 en later aangepast aan celsystemen van zoogdieren, waarvoor het protocol zijn volledige potentieel heeft aangetoond bij het detecteren van korteafstandskenmerken van het 3D-genoom, zoals chromosoomlussen en isolatieplaatsen. Deze versie is gebaseerd op recente publicaties van zoogdieren Micro-C-XL 4,5. Omdat Micro-C-XL Micro-C vervangt, wordt Micro-C-XL in het manuscript voortaan Micro-C genoemd.
De belangrijkste verschillen tussen Micro-C en Hi-C6 zijn als volgt: 1) genoomfragmentatie met microkokkennuclease (MNase) in vergelijking met restrictie-enzymen en 2) extra crosslinkers met grotere atomaire afstand tussen de reactieve groepen in vergelijking met alleen formaldehyde. Beide stappen dragen aanzienlijk bij aan de verbeterde signaal-ruisverhouding van Micro-C in vergelijking met conventionele Hi-C. De fragmentatiegrootte beperkt de resolutie waarmee de 3D-genoomorganisatie kan worden opgelost tijdens het proximity-ligatieprotocol. MNase is een nuclease dat bij voorkeur toegankelijk DNA verteert en nucleosomaal beschermd DNA intact laat. Nucleosoomvoetafdrukken met behulp van MNase-sequencing hebben aangetoond dat nucleosomen de meeste eukaryote genomen volledig bedekken7. Aangezien nucleosomen over het hele genoom zijn verdeeld met een gemiddelde afstand van 160-220 bp, afhankelijk van de soort en het celtype, is MNase het ideale enzym voor het in kaart brengen van de genoomarchitectuur met hoge resolutie.
Het gebruik van een extra crosslinker in combinatie met formaldehyde (FA) in de Micro-C-methode verbetert bovendien de signaal-ruisverhouding 2,8. Amine-specifieke crosslinkers met langere atomaire spacers tussen de reactieve groepen vergemakkelijken eiwit-eiwit crosslinks. Dit zijn meestal disuccinimidylglutaraat (DSG) of ethyleenglycolbis-succinimidylsuccinaat (EGS) met respectievelijk 7,7 Å en 16,1 Å afstandhouders. De vermindering van ruis door EGS of DSG is vooral duidelijk in experimenten met hoge fragmentatiesnelheden, zoals Micro-C, en treedt vermoedelijk op als gevolg van een vermindering van de snelheid van willekeurige ligatiegebeurtenissen8.
Een recent ontwikkeld Hi-C 3.0-protocol dat gebruikmaakt van ESG/DSG-crosslinking en meerdere combinaties van restrictie-enzymen, vermindert ruis in Hi-C-experimenten en verbetert de detectie van chromosoomlussen en isolatieplaatsen aanzienlijk 8,9. Toch bleek uit een site-by-site vergelijking van verschillende interactiegegevensfuncties dat Micro-C een superieure detectie had van korteafstandskenmerken, zoals chromosoomlussen en isolatieplaatsen, in vergelijking met zowel Hi-C 3.0 als conventionele Hi-C8. Hi-C 3.0 verbetert echter wel de detectie van korteafstandskenmerken en handhaaft een sterke detectie van genoomcompartimentering in vergelijking met conventionele Hi-C. Samenvattend kan worden gesteld dat de keuze van een methode voor het vastleggen van chromosomen moet worden bepaald door de objectieve en biologische vraag.
Hier bieden we een stapsgewijs protocol voor succesvolle Micro-C-experimenten die de organisatie van het 3D-genoom kunnen ontrafelen.
Protocol
1. Celkweek en verknoping Kweekcellen volgens de experimentele behoeften om minimaal 1 x 107 cellen te verkrijgen. Hier werden de cellen gekweekt bij 37 °C met 5% CO2 in E14-medium (DMEM met pyruvaat en L-glutamine, 15% FBS, 1x LIF, 1x NEAA, 1% pen-strepto, 0,1 mM β-mercaptoethanol [zie Materiaaltabel]) en om de dag gepasseerd.OPMERKING: Dit protocol is met succes toegepast op verschillende celtypen van meerdere soorten, zoals Homo sapiens en Mus musculus. In dit voorbeeld werden embryonale stamcellen (ES) van muizen gebruikt. Oogst de cellen bij 70%-80% confluentie door het medium op te zuigen. Eenmaal wassen met 5 ml DPBS en de cellen incuberen met 3 ml voorverwarmde 0,25% trypsine per schaal van 10 cm gedurende 2-3 minuten bij 37 °C. Blus de trypsine af met 7 ml voorverwarmd E14-medium en breng de losgemaakte cellen over in een buisje van 50 ml. Pelleteer de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Gooi het supernatans weg en repsuspendeer de celpellet in het medium. Tel de cellen met een cellenteller.OPMERKING: Het protocol is robuust voor enige variatie in celconcentraties, en er zijn verschillende celtellers gebruikt om de celaantallen te kwantificeren; Houd echter rekening met het dynamische bereik van de gebruikte cellenteller. Dit is meestal tussen 1 x 105-1 x 107 cellen/ml. Hoewel de centrifugatiesnelheid en -duur voor dit celtype zijn getest, kunnen verschillende, kleinere cellen een hogere centrifugatiesnelheid of langere centrifugetijden vereisen, en de centrifugatie moet dienovereenkomstig worden aangepast. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT en resuspendeer de cellen in DPBS bij een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/ml. Als de opbrengst bijvoorbeeld 1 x 107 cellen is, resuspendeer de cellen dan in 10 ml DPBS. Voeg voor de eerste verknopingsstap 37% formaldehyde (FA) toe tot een eindconcentratie van 1% aan de celsuspensie en incubeer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij RT met rotatie (15-20 rpm); als voorbeeld, als de opbrengst 1 x 107 cellen is, voeg dan 270 μL FA toe aan de celsuspensie van 10 ml.OPMERKING: De FA-oplossing is doorgaans tot 3 maanden na opening stabiel bij RT. Doof de reactie door 2,5 M glycine toe te voegen tot een eindconcentratie van 0,25 M en incubeer gedurende 5 minuten bij RT met rotatie (15-20 rpm). Als de opbrengst bijvoorbeeld 1 x 107 cellen is, voeg dan 1,027 ml 2,5 M glycine toe aan de celsuspensie. Verzamel de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in 5 ml DPBS. Herhaal de centrifugatiestap eenmaal en resuspendeer de gepelleteerde cellen in DPBS tot 4 x 106 cellen/ml. Als de opbrengst bijvoorbeeld 1 x 107 cellen is, resuspendeer de cellen dan in 2,5 ml DPBS. Bereid voor de tweede verknopingsstap een 0,3 M stockoplossing van ethyleenglycolbis-succinimidylsuccinaat (EGS) in DMSO (13,6 mg EGS in 100 μL DMSO). Voeg EGS in een eindconcentratie van 3 mM toe aan de celsuspensie en incubeer bij RT gedurende 40 minuten met rotatie (15-20 rpm). Als de opbrengst bijvoorbeeld 1 x 107 cellen is, voeg dan 25 μl 0,3 M EGS-stockoplossing toe aan 2,5 ml van de celsuspensie.OPMERKING: Breng de EGS ten minste 20 minuten in evenwicht met RT voordat u gaat wegen voor het bereiden van de voorraadoplossing. Blus de reactie door 2,5 M glycine toe te voegen tot een eindconcentratie van 0,4 M en incubeer gedurende 5 minuten bij RT met rotatie (15-20 rpm). Als de opbrengst bijvoorbeeld 1 x 107 cellen is, voeg dan 400 μL 2,5 M glycine toe aan de celsuspensie. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij RT en resuspendeer de gepelleteerde cellen in DPBS tot 5 x 106 cellen/ml. Verdeel 5 x 10 6 cellen/buis voor preparatieve bibliotheken en 1 x 106 cellen/buis voor titratie voor MNase-vertering.OPMERKING: Er wordt voorgesteld om de optimale verteringsgraad voor elke verknoopte celbatch te titreren. Verzamel idealiter twee tot drie aliquots van 1 x 10 6 cellen voor MNase-titratie-experimenten (stap 2) en twee tot vier aliquots van 5 x 106 cellen voor voorbereidende experimenten (stap 3). Verzamel de cellen door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij RT en verwijder het supernatant. Vries de celpellets snel in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij -80 °C.OPMERKING: Succesvolle Micro-C-bibliotheken kunnen worden bereid op basis van monsters die maximaal 3 maanden zijn bewaard. 2. MNase titratie OPMERKING: Het uitvoeren van een MNase-titratie is noodzakelijk om de optimale concentratie MNase te bepalen voordat de preparatieve bibliotheek van de dubbel verknoopte cellen wordt verwerkt. Om de MNase-titratie uit te voeren, ontdooit u een pellet van 1 x 106 cellen gedurende 10 minuten op ijs en resuspendeert u de cellen in 500 μL DPBS (voeg 1x BSA toe als de cellen aan de wand blijven plakken). Incubeer de celsuspensie gedurende 20 minuten op ijs. Verzamel de cellen door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij RT en verwijder het supernatant. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 500 μL MB#1-buffer (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2,0,2% NP-40, 1x proteaseremmer [zie materiaaltabel], pH 7,4). Verzamel de cellen door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 200 μL MB#1-buffer en verdeel het monster in vier buisjes. Ontdooi één injectieflacon MNase (20 E/μL) en verdun met 10 mM Tris, pH 7,4, in een reeks van 1:2, 1:4, 1:4 en 1:4 om concentraties van respectievelijk 10 E/μL, 2,5 E/μL, 0,625 U/μL en 0,1256 E/μL te bereiken (één voor elke verteringstoestand). Voeg met de juiste tijdsintervallen (10-20 s) 1 μL MNase-oplossing toe aan een van de vier monsters, vortex, en incubeer op een thermomixer bij 37 °C gedurende 10 minuten (800 rpm schudden). Ga verder met het toevoegen van 1 μL van de resterende MNase-verdunningen aan de resterende celaliquots. Stop de Mnase-vertering door 200 μL vers bereide STOP-buffer (150 μL 10 mM Tris, pH 7,4, 25 μL 10 % SDS, 25 μL 20 mg/ml proteïnase K, 2 μL 0,5 M EGTA) toe te voegen aan elke buis in dezelfde volgorde en met hetzelfde tijdsinterval dat het MNase werd toegevoegd. Incubeer bij 65 °C gedurende 2 uur. Voeg 500 μL fenol-chloroform-isoamylalcohol (PCI) toe aan elk monster en meng grondig door middel van vortexen. Centrifugeer bij 19.800 x g gedurende 5 minuten bij RT om de fasen te scheiden en breng de waterige fase over naar nieuwe buisjes (ongeveer 200 μl/monster).LET OP: PCI bevat tal van giftige componenten en mag alleen worden gehanteerd in een chemische veiligheidskap. Neem contact op met de fabrikant voor meer informatie. Zuiver het DNA met behulp van een in de handel verkrijgbare DNA-zuiveringskit (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant en elute de monsters in een elutiebuffer van 12 μl.OPMERKING: De SDS-concentratie van de deproteinisatiestap (stap 2.5) is remmend voor sommige DNA-zuiveringskits. De DNA-zuiveringskit die hier wordt gebruikt, presteert vergelijkbaar met ethanolneerslag. Voeg 2-5 μL laadkleurstof toe en laat de monsters gedurende 30-50 minuten op een 1,5% agarosegel bij 120 V lopen (tot ze goed gescheiden zijn; Figuur 1A). Kies de beste mate van vertering voor het experiment en ga verder met de preparatieve MNase-vergisting. Een optimale verteringsgraad vertoont weinig tot geen subnucleosomale fragmenten en een mono- tot dinucleosoomverhouding van 70%-90%.OPMERKING: In dit experiment werd de verteringsgraad van baan 4 in figuur 1A bepaald als de optimale vertering die werd verkregen met 0,625-1,25 U Mnase voor 2,5 x 10 5 cellen (= 2,5-5 U Mnase voor 1 x 106 cellen). Voor een gedetailleerde bespreking, zie de representatieve resultaten. 3. Voorbereidende MNase-vertering Om chromatine via MNase-digestie naar de mononucleosomen te fragmenteren, ontdooit u eerder dubbel verknoopte 5 x 106-celaliquots en resuspendeert u in 1 ml DPBS. Incubeer 20 minuten op ijs (voeg 1x BSA toe als de cellen aan de buiswand blijven plakken). Verzamel de cellen door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de pellet in 500 μL MB#1 buffer. Herhaal de centrifugatiestap eenmaal. Resuspendeer de pellet in 1 ml MB#1-buffer en maak aliquots van 200 μl (1 x 106 cellen per aliquot). Op basis van de MNasetitratie (beschreven in stap 2) verteert u het chromatine door de juiste hoeveelheid MNase (meestal 2,5-10 E/μL per 1 x 106 cellen) aan elk aliquot toe te voegen. Meng goed (draai en draai snel) en incubeer op een thermomixer bij 37 °C gedurende 10 minuten met 800 rpm schudden. Stop de MNase-vergisting door 1,6 μL 0,5 M EGTA (laatste 4 mM) toe te voegen aan elk aliquot en incubeer op een thermomixer bij 65 °C gedurende 10 minuten met 800 tpm schudden. Verzamel het monster door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de celpellet in 500 μL 1x NEBuffer 2.1. Poolmonsters die overeenkomen met een invoer van 5 x 106 cellen of minder voor verdere verwerking.OPMERKING: Als er meer dan 5 x 10 6 cellen moeten worden verwerkt, verwerk deze monsters dan parallel, aangezien de enzymatische omstandigheden zijn geoptimaliseerd voor 5 x 106 cellen. Voordat u doorgaat met de stappen voor nabijheidsligatie, moet u 10% van het monster overbrengen als invoercontrole om het MNase-verteringsniveau te controleren. Voeg 150 μl 10 mM Tris, pH 7,4, 25 μl 10% SDS en 25 μl 20 mg/ml proteïnase K toe aan dit monster en incubeer een nacht bij 65 °C. 4. DNA-eindverwerking en nabijheidsligatie Verzamel het resterende monster door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de pellet in 90 μL vers bereide Micro-C mastermix 1 (tabel 1) en incubeer gedurende 15 minuten op een thermomixer bij 37 °C met 800 rpm schudden. Voeg 10 μL 5 E/μL Klenow Fragment toe en incubeer op een thermomixer gedurende 15 minuten bij 37 °C met 800 rpm schudden. Voeg 100 μL vers bereide Micro-C mastermix 2 (tabel 2) toe en incubeer op een thermomixer gedurende 45 minuten bij 25 °C met 800 rpm schudden. Na incubatie de enzymatische reactie blussen door EDTA toe te voegen tot een eindconcentratie van 30 mM. Incubeer op een thermomixer gedurende 20 minuten bij 65 °C met 800 rpm schudden. Verzamel het monster door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Resuspendeer het monster in 500 μl vers bereide Micro-C-mastermix 3 (tabel 3) en incubeer gedurende 2,5 uur bij RT met rotatie (15-20 rpm). Verzamel het monster door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Resuspendeer het monster in 200 μl vers bereide Micro-C mastermix 4 (tabel 4) en incubeer gedurende 15 minuten op een thermomixer bij 37 °C met 800 rpm schudden. Voeg voor omgekeerde verknoping en deproteïnenatie 25 μl 20 mg/ml proteïnase K en 25 μl 10% SDS toe aan het monster en incubeer ‘s nachts bij 65 °C met intermitterend mengen. 5. Dinucleosomale DNA-zuivering en grootteselectie Voeg 500 μL PCI toe aan de samples en de ingangsregeling en meng door middel van vortexen. Scheid de fasen door centrifugeren bij 19.800 x g gedurende 5 minuten en breng de bovenste waterige fase over in een nieuwe buis. Concentreer het DNA met behulp van een DNA-zuiveringskit of door ethanolprecipitatie. Eluer de monsters in 30 μl (stap 5.3) en de ingangscontroles (stap 3.11) in 15 μl, en laat een 1,5 % agarosegel lopen om de mononucleosomen en dinucleosomen te scheiden (figuur 1B).OPMERKING: De SDS-concentratie van de deproteinisatiestap is remmend voor sommige DNA-zuiveringskits. De DNA-zuiveringskit die hier wordt gebruikt (zie Materiaaltabel) presteert vergelijkbaar met ethanolneerslag. Afhankelijk van het aantal gebruikte cellen kan de input variëren van 100 ng tot 10 μg. Meestal wordt 1-5 μg DNA geëxtraheerd uit 5 x 106 cellen. Snijd de DNA-fragmenten met een dinucleosomale grootte (ongeveer 300 bp) weg. Gebruik een in de handel verkrijgbare DNA-gel-elutiekit (zie Materiaaltabel) om het DNA uit de agarosegel te extraheren en elute in 150 μL. 6. Bereiding van de streptavidinekorrels Breng 10 μL streptavidinekorrels (zie materiaaltabel) per monster over in een reactiebuisje. Plaats het in een geschikte magneet voor slangen van 1.5 ml (zie Materiaaltabel). Nadat de oplossing is verdwenen (1-2 min), verwijdert u het supernatant en resuspendeert u de korrels in 300 μL 1x TBW (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween 20) per monster. Herhaal deze stap één keer. Resuspendeer de korrels in 150 μL 2x zwart-witbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) per monster verwerkt in stap 7. 7. Streptavidin pull-down en voorbereiding op de kralenbibliotheek Voeg 150 μl kant-en-klare parels (stap 6.3) toe aan 150 μl van het monster (stap 5.3). Incubeer gedurende 20 minuten bij RT met rotatie (15-20 rpm). Plaats de buisjes in een geschikte magneet en wacht tot de oplossing helder is (1-2 min). Verwijder het supernatans en resuspendeer de korrels in 300 μL of 1x TBW. Herhaal deze stap. Plaats de buisjes in een geschikte magneet en wacht tot de oplossing helder is (1-2 min). Verwijder het supernatans en resuspendeer de korrels in 100 μL van 0,1x TE (1 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Plaats de buisjes in een geschikte magneet en wacht tot de oplossing helder is (1-2 min). Verwijder het supernatant, resuspendeer de korrels in 50 μL 0,1x TE en breng ze over naar PCR-buisjes.OPMERKING: Het gebruikte volume van 0,1x TE (50 μL) komt overeen met het invoervolume van de voorbereidingskit voor de DNA-sequencingbibliotheek (zie Materiaaltabel) die in dit protocol wordt gebruikt. Als er een andere kit of strategie wordt gebruikt, pas dan het volume dienovereenkomstig aan. Voer de DNA-manipulatiestappen van de voorbereidingskit voor de sequencingbibliotheek uit volgens het protocol van de fabrikant. Deze stappen omvatten meestal DNA-afstomping, A-tailing, adaptorligatie en U-excisie. De laatste stap (U-excisie) is specifiek voor de kit die in dit onderzoek is gebruikt. Als u die kit gebruikt, volg dan de instructies van de fabrikant van stap 1 tot stap 2.6 in het kitprotocol met behulp van niet-verdunde adapters, en overweeg geen opslag van −20 °C na stap 2.6.OPMERKING: De bufferveranderingen die nodig zijn voor de sequentiekits moeten worden uitgewisseld door de kralen aan een magneet te binden en te wassen (stappen 7.3 tot 7.4), aangezien DNA nog steeds aan de streptavidinekorrels is gebonden. Bovendien, omdat het DNA aan de magnetische kralen is gebonden, moet u alle zuiverings- en maatselectiestappen negeren na het afbinden van de adapter uit het kitprotocol. Ga verder met stap 7.6 (dit protocol). Nadat het afbinden van de adapter is voltooid, wast u het monster zoals beschreven in stap 7.2. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de korrels in 20 μL 0,1x TE. 8. Schatting van de vereiste PCR-cycli OPMERKING: Het is raadzaam om een schatting te maken van de vereiste PCR-cycli voor bibliotheekamplificatie. Doorgaans vereist een Micro-C-bibliotheek 8-15 PCR-cycli. Hoewel de stap niet essentieel is, helpt het overamplificatie te voorkomen en vermindert het het risico op PCR-duplicaten. Om het minimaal vereiste aantal PCR-cycli te bepalen, voert u PCR uit met 1 μL streptavidine-biotine-DNA-monster (stap 7.6). Voeg hiervoor PCR-mastermix (3,2 μLH2O, 0,4 μL i5-primer, 0,4 μL i7-primer en 5 μL Q5 high-fidelity DNA-polymerase) toe aan het monster. Voer PCR uit met 16 cycli volgens de instructies van de fabrikant voor de gebruikte DNA-bibliotheekvoorbereidingskit.OPMERKING: De primers die hier worden gebruikt, worden gekocht in een aparte kit (zie Materiaaltabel) die compatibel moet zijn met de gebruikte bibliotheekvoorbereidingskit. Verzamel na de PCR de korrels met een geschikte magneet en meet de DNA-concentratie van 1 μL van het supernatans met behulp van een zeer gevoelig DNA-kwantificeringsinstrument (zie Materiaaltabel). Om de totale DNA-concentratie te verkrijgen, vermenigvuldigt u deze waarde met 10 (totaal volume van de PCR-reactie). Maak een schatting van het benodigde aantal PCR-cycli zoals besproken in de representatieve resultaten. Voeg 2 μL 6x laadbuffer toe aan de resterende 9 μL PCR-mengsel. Los de PCR-geamplificeerde bibliotheek op een 1% agarosegel op om een succesvolle afbinding van de adapter te bepalen, wat resulteert in een grootte van ongeveer 450 bp (Figuur 1C).OPMERKING: De gel moet een duidelijke band van ongeveer 420 bp vertonen (Micro-C-bibliotheek plus adapters). Banden van 120 bp vertegenwoordigen adapterdimeren en zijn indicatief voor bibliotheken met een lage complexiteit. Er kunnen banden met een lager molecuulgewicht verschijnen (minder dan 100 bp), en dit zijn ongebruikte primers van de PCR-reactie. 9. Sequencing bibliotheek versterking Voeg PCR-mastermix (65 μLH2O, 100 μL Q5 high-fidelity DNA-polymerase, 8 μL i5-primer, 8 μL i7-primer) toe aan de resterende 19 μL van het streptavidine-biotine-DNA-monster. Verdeel het reactiemengsel in aliquots van 50-100 μL.OPMERKING: Het optimale volume voor de PCR is afhankelijk van de PCR-machine; doorgaans biedt 50 μL de meest reproduceerbare amplificatie in gangbare PCR-machines. Voer PCR uit volgens de instructies van de fabrikant van de DNA-bibliotheekvoorbereidingskit met het aantal cycli bepaald in stap 8. Als stap 8 is overgeslagen, worden 14 cycli aanbevolen voor PCR. Zuiver het DNA met paramagnetische kralen (zie Materiaaltabel) in een verhouding van 1:0,9 volgens het protocol van de fabrikant. Elute in 20 μL van 0,1% TE.NOTITIE: Als in stap 8.5 adapterdimeren worden gedetecteerd, voer dan twee keer zuivering uit met dezelfde verhouding. Bepaal de DNA-concentratie en voer de monsters uit op een kwaliteitscontrolesysteem (zie Tabel met materialen). Zorg voor een goede kwaliteit van de Micro-C-bibliotheek door de aanwezigheid van een enkele nauwkeurige band (Figuur 1D).OPMERKING: Adapterdimeren zijn ongebruikelijk in preparaten op de kralenbibliotheek vanwege de monsterwasbeurten vóór de PCR. Het uiterlijk van adapterdimeren duidt dus op een lage complexiteit van de bibliotheek. Als adapterdimeren worden waargenomen, wordt het ten zeerste aanbevolen om de kwaliteit van het monster te controleren met sequencing met een lage input. 10. DNA-sequencing en gegevensverwerking Sequentie van de Micro-C-bibliotheek met paired-end sequencing volgens de vereisten van de sequencingprovider.OPMERKING: Idealiter worden de samples gesequenced op een platform in paired-end-modus met 50 bp per lezing. Oudere platforms die kortere leeslengtes bieden, zoals 2 x 35 bp, zijn ook met succes gebruikt. Belangrijk is dat als repetitieve genomische regio’s worden bestudeerd, het raadzaam kan zijn om de sequentie met een langere leeslengte te bepalen. Om de kwaliteit van de Micro-C-bibliotheek te beoordelen, voert u sequencing met lage input uit met 5 x 106 tot 1 x 107 lezingen per sample. Verwerk de sequencing files (fastq files) met Distiller10. Breng de aflezingen in kaart aan de hand van het juiste referentiegenoom, hier mm10.OPMERKING: De volgordebestanden kunnen worden verwerkt met behulp van verschillende pijplijnen op lokale computers of computerclusters. Voor monsters met een lage sequentiediepte kunnen grotere opslaglocaties, zoals 10.000 bp, 50.000 bp, 100.000 bp en 500.000 bp, de rekenbehoefte en bestandsgrootte verminderen. Distiller (gebruikt in dit onderzoek) genereert alle vereiste bestandstypen om de kwaliteit van de Micro-C-bibliotheek te beoordelen. Het gegenereerde *.stats-bestand bevat de informatie over de kaartsnelheid, cis-trans-verhoudingen en leesoriëntatie, gestratificeerd door de afstand tussen de leesparen. Deze parameters worden gevisualiseerd in figuur 2 en de beoordeling van de kwaliteit van de Micro-C-bibliotheek wordt besproken in de representatieve resultaten. De verwerkingssoftware genereert ook mcool-bestanden die rechtstreeks in HiGlass (https://docs.higlass.io/) kunnen worden geladen om interactiematrices9 te genereren.
Representative Results
De succesvolle voorbereiding van Micro-C-bibliotheken kan in verschillende stappen van het protocol worden geëvalueerd. De belangrijkste stap is de keuze van een goede MNase-verteringsgraad. Daarom moet de MNase-concentratie worden getitreerd om consistent 70%-90% mononucleosomen te verkrijgen ten opzichte van di-nucleosomen voor elk monster. Het is belangrijk op te merken dat de vertering van chromatine verschillend is voor eu- en heterochromatine, waarbij MNase heterochromatine minder efficiënt verteert. De optimale verteringsgraad hangt dus af van het interessegebied van het chromatine en het bestudeerde celtype, aangezien het relatieve aandeel van eu- en heterochromatine celtypespecifiek is. Daarom is het raadzaam om de vereiste MNase-concentratie zorgvuldig te titreren en eerst het succes van het Micro-C-experiment te evalueren door middel van low-input sequencing. Een typisch MNase-titratiepatroon van chromatine behandeld met afnemende hoeveelheden MNase wordt weergegeven in figuur 1A. Hier wordt chromatine van 250.000 cellen per reactie verteerd met een viervoudige verdunning van MNase. De hoogste concentratie (10 U van MNase, Lane 2) vertoont oververteerd chromatine dat bijna uitsluitend bestaat uit mononucleosomaal DNA (~150 bp). Met name het midden van de mono-nucleosomale band loopt lager in de agarosegel in vergelijking met de overeenkomstige banden in de monsters met verlaagde MNase-concentraties, wat wijst op een oververtering van nucleosomaal DNA. Oververteerde nucleosomen worden inefficiënt geligeerd in de nabijheidsligatiereactie; daarom is het monster in baan 2 suboptimaal voor Micro-C-experimenten. Baan 3 (2,5 U van MNase) vertoont een bijna geschikte verteringsgraad voor Micro-C-experimenten. Hier is de mononucleosomale band de dominante soort en is het subnucleosomale uitstrijkje, indicatief voor oververteerde nucleosomen, verminderd; Het is echter nog steeds aanwezig. De verteringsgraad in baan 4 (0,635 U van MNase) is een ideale conditie voor een Micro-C-experiment in dit titratievoorbeeld. Er is een duidelijke mono-nucleosomale band zonder subnucleosomaal DNA aanwezig. De bandintensiteit voor het mono- en dinucleosoom-DNA is bijna gelijk, wat wijst op een mono-nucleosoomopbrengst van 66% of hoger. Het is vermeldenswaard dat het di-nucleosomale DNA ongeveer twee keer zo groot is als het mono-nucleosomale DNA (~320 bp vs. ~150 bp), dus de bandintensiteit per mol DNA is twee keer zo hoog in vergelijking met zijn mono-nucleosomale tegenhanger. De verteringsgraad in baan 5 (0,156 U van MNase) toont onderverteerd chromatine met bijna geen nucleosomaal DNA, en dit vertegenwoordigt daarom een suboptimaal monster. Concluderend biedt in dit voorbeeld de vertering van 2,5 x 105 ES-cellen van muizen met 0,625 U MNase (overeenkomend met 2,5 U MNase voor 1 x 106 cellen in 200 μL) het meest veelbelovende startpunt voor preparatieve digesties in Micro-C-experimenten. Er moet echter ook rekening worden gehouden met een intermediaire MNaseconcentratie tussen de omstandigheden die worden gebruikt voor de monsters in baan 3 en baan 4 (overeenkomend met 5 U MNase voor 1 x 106 cellen in 200 μl). Belangrijk is dat chromatine-digestie met MNase niet lineair kan worden geschaald en dat het niet wordt aanbevolen om de preparatieve digestie meer dan 4x op te schalen. Om Micro-C-bibliotheken van meer dan 1 x 10 6 cellen te bereiden, is het raadzaam om het chromatine te verteren in aliquots van 1 x 106 cellen en deze samen te voegen na MNase-inactivering. Om het succes van het proximity-ligatieprotocol te beoordelen, moet de inputcontrole, die MNase-verteerd is en niet proximity-ligated (stap 3.8), worden vergeleken met het proximity-ligated monster (stap 5.3) door 1,5% agarosegelelektroforese (Figuur 1B). De proximity-ligated mono-nucleosoomband heeft een geschatte grootte van 300 bp, vergelijkbaar met die van di-nucleosomen. Daarom moet de signaalverhouding tussen de mono- en dinucleosomale band verschuiven van overwegend mononucleosomen (baan 1) naar dinucleosomen (baan 3 en baan 4). Aangezien de agarosegel in deze stap het dinucleosomaal DNA is dat wordt weggesneden en gezuiverd, is het raadzaam om de monsters in meerdere banen te splitsen om overbelasting te voorkomen. Het wordt aanbevolen om de kwaliteit en kwantiteit van de voorbereide sequencingbibliotheek te beoordelen met minimale PCR. Hier wordt DNA van 1 μL kralen (1/20 van het totale monster) gedurende 16 cycli geamplificeerd in 10 μL PCR-reactie. De totale concentratie van de minimale PCR-bibliotheek varieert doorgaans van 50-500 ng na 16 PCR-cycli. In theorie komt dit overeen met een bibliotheek van 1-10 μg uit het resterende monster van 19 μL als het ook gedurende 16 cycli zou worden geamplificeerd. Het wordt aanbevolen om het minimale aantal PCR-cycli te gebruiken dat nodig is om een bibliotheek van ongeveer 100 ng uit het totale DNA te genereren. Uitgaande van logaritmische amplificatie in de PCR, kan de theoretische concentratie van het DNA verkregen uit de invoer van 19 μL na 16 cycli achtereenvolgens door twee worden gedeeld om het aantal PCR-cycli te berekenen dat nodig is om een bibliotheek van 100 ng te genereren. Een opbrengst van 100 ng van 1 μL na 16 cycli komt bijvoorbeeld overeen met een opbrengst van 1.900 ng versterkt van 19 μL. In dit scenario zouden 12 cycli idealiter een sequentiebibliotheek van 118 ng moeten genereren uit het totale DNA (1.900 ng/[2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng). Het resterende monster van 9 μL van de minimale PCR kan vervolgens worden gebruikt om de kwaliteit van de bibliotheek te beoordelen door middel van agarosegelelektroforese (Figuur 1C). Visualisatie moet één afzonderlijke band tonen bij 420 bp en geen banden voor adapterdimeren (120 bp). Er kunnen ook kleinere fragmenten verschijnen, en deze komen overeen met ongebruikte PCR-primers. Vervolgens wordt aanbevolen om succesvolle Micro-C-monstervoorbereiding te analyseren en te bevestigen door middel van low-input sequencing voordat u zich vastlegt op resource-intensieve diepe sequencing. Doorgaans worden bibliotheken gesequenced op een leesdiepte van 5 x 106 tot 1 x 107 en geëvalueerd op basis van de volgende criteria: de sequencing read duplication rate, de cis- versus trans-chromosomale interactiesnelheid en de sequencing read orientation frequency. De Micro-C-bibliotheken worden verwerkt met Distiller, een full-service pijplijn die de gegevens verwerkt van sequencing van leesbestanden (Fastq-formaat) tot leesparenbestanden (Bedpe-formaat) en schaalbare interactiematrices (Cool- en Mcool-formaten) met behulp van cooler, pairtools en cooltools10,11,12. De pijplijn genereert ook een overzichtsbestand dat ideaal is voor het beoordelen van de kwaliteit van de Micro-C-bibliotheken10 (https://github.com/open2c/distiller-nf). De PCR-duplicatiesnelheid geeft informatie over de complexiteit van de sequencingbibliotheek en kan worden geëxtraheerd uit het gegenereerde *.stats-bestand. Micro-C-bibliotheken van hoge kwaliteit hebben minder dan 5%-10% PCR-duplicatiepercentages wanneer ze worden gegenereerd uit 5 miljoen of meer cellen. Met name sommige sequencingplatforms genereren PCR-duplicaten tijdens clustervorming, onafhankelijk van de complexiteit van de sequencingbibliotheek. Figuur 2A toont de relatieve duplicatiepercentages van twee experimenten: een die we als een goede steekproef beschouwen en een slechte steekproef. In dit voorbeeld gaven beide steekproeven acceptabele kaartsnelheden weer. De volgende criteria om de kwaliteit van Micro-C-bibliotheken te beoordelen, zijn de cis- versus trans-verhouding en de leesoriëntatiefrequenties. Binnen de kern bewonen chromosomen individuele chromosomengebieden en hebben ze dus zelden interactie met andere chromosomen. Een hoog percentage gedetecteerde transchromosomale interacties duidt op een hoog percentage willekeurige ligaties. Opgemerkt moet worden dat op dit analyseniveau het slechte monster een hoog percentage transchromosomale interacties vertoonde in vergelijking met het goede monster (figuur 2B). Voor Micro-C is een cis-chromosomale interactiesnelheid van 70% of hoger wenselijk. Een Micro-C-bibliotheek heeft een fragmentgrootte die vergelijkbaar is met de di-nucleosomale DNA-band, die samen met het nabijheidsgeligeerde monster kan zuiveren en het experiment kan besmetten. Deze verontreinigingen zijn altijd cis-chromosomale interacties. Daarom is het belangrijk om ook de leesoriëntatiepercentages te evalueren. De snelheid van dinucleosomale besmetting kan worden geschat door sequencing met een lage input. Dinucleosomaal DNA stamt af van twee naburige nucleosomen die niet door MNase zijn gesplitst. De resulterende sequencing-lezingen zullen dus altijd een voorwaarts-achterwaartse leesoriëntatie (F en R) weergeven en de afstand tussen de leesparen zal ongeveer 320 bp zijn. Proximity-geligeerde fragmenten kunnen daarentegen in vier oriëntaties worden geligeerd, wat leesparen oplevert met F-R, R-R, R-F en F-F, idealiter met gelijke abundantie (Figuur 2C). Bovendien geven ze verschillende afstanden weer tussen de twee leesparen. Om de hoeveelheid dinucleosomale verontreinigingen te schatten, kan de frequentie van leesoriëntaties worden berekend aan de hand van de *stats-bestanden die door de distilleerder worden gegenereerd (Figuur 2D). Met name in dit werk was de fractie van F-R-aflezingen (rood) hoger in de slechte steekproef in vergelijking met de goede steekproef, en dit werd duidelijker toen de leesoriëntaties werden gestratificeerd naar afstand (Figuur 2E). De F-R-fractie wordt gedomineerd door di-nucleosomale fragmenten in vergelijking met Micro-C-bibliotheken wanneer de leesparen worden gestratificeerd in aflezingen met afstanden <562 bp of ≥562 bp. Hier wordt de fractie van de metingen met een afstand <562 bp gedomineerd door F-R-metingen, terwijl de fractie met afstanden ≥562 bp een gelijkmatige verdeling vertoont tussen de vier mogelijke oriëntaties, wat aangeeft dat de globale oververtegenwoordiging van F-R-metingen voortkomt uit dinucleosomale verontreinigingen. De keuze van 562 bp als drempel voor subsetering wordt bepaald door de binning in het gegenereerde *stats-bestand. Hoewel dit niet nodig is voor deze kwaliteitscontrole, kan een meer gedefinieerde subset worden bereikt door de afstanden te extraheren uit het *pairs-bestand, dat ook door de distilleerder wordt gegenereerd. Het is belangrijk op te merken dat dinucleosomale metingen de kwaliteit van het Micro-C-monster niet verminderen, omdat ze tijdens de gegevensverwerking kunnen worden geïdentificeerd en genegeerd. Ze bevatten echter geen waardevolle informatie over 3D-interacties en ze verdunnen de informatieve lezingen. Zorgvuldige MNase-titratie en grondige kwaliteitscontrole met low-input sequencing zijn dus de beste hulpmiddelen om de kwaliteit van Micro-C-experimenten te optimaliseren. Figuur 1: Tussenstadia van het Micro-C protocol . (A) Agarosegelelektroforese van chromatine uit 2,5 x 105 ES-cellen van muizen verteerd met variërende MNase-concentraties. De mono-, di- en tri-nucleosomale banden worden aangegeven met pijlen. M: DNA-ladder (baan 1/6); 10 U MNase per 250.000 cellen (baan 2); 2,5 U MNase per 250.000 cellen (baan 3); 0,625 U MNase per 250.000 cellen (baan 4); 0,156 U MNase per 250.000 cellen (Lane 2). (B) De 1,0% agarosegelelektroforese van de Micro-C geprepareerde monsters (Lane 3 en Lane 4) en de MNase verteerde inputcontrole (Lane 1). Baan 1 en Baan 2 (M: DNA-ladder) zijn verbeterd om de relatieve verandering in de intensiteit van mono- tot dinucleosomale fragmenten te benadrukken. De mono- en dinucleosomale banden worden aangegeven met pijlen. De di-nucleosomale band in het nabijheidsgebonden monster combineert di-nucleosomaal en Micro-C-bibliotheek-DNA. (C) De 1,0% agarosegelelektroforese van de Micro-C-sequencingbibliotheken versterkt uit een monster van 1 μL om de kwaliteit te evalueren. Baan 1 (M): DNA-ladder; Baan 2 (S): Mirco-C bibliotheek. (D) Fragment Analyzer-spoor van de uiteindelijke Micro-C-bibliotheek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Steekproefstatistieken voor de low-input sequencing van een goede en een slechte steekproef . (A) Staafdiagram van het percentage in kaart gebrachte (groen) en niet-toegewezen (rood) afleest. (B) Genormaliseerde fractie van reads die cis- en transchromosomale interacties in kaart brengen. De datasets werden genormaliseerd naar de cis-mapping read. De cis-mapping-metingen werden gestratificeerd op basis van de afstand tussen de eerste en de tweede lezing van de gepaarde sequentiemonsters: ≤1 kbp (geel), >1 kbp en ≤10 kbp (oranje) en >10 kbp (rood). (C) Schema van de potentiële molecuulsoorten met de dinucleosomale groottes. (D) Percentages van leespaaroriëntaties van alle aflezingen van de goede en de slechte steekproef. (E) Zelfde als paneel (D) maar gestratificeerd naar afstanden (links, <562 bp en rechts, ≥562 bp). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Onderdelen 1x 4,4 keer 10x NEBuffer 2.1, 10 μL 44 μL 2 μL 100 mM ATP 2 μL 8,8 μL 100 mM DTT 5 μL 22 μL H2O 68 μL 299,2 μL 10 E/μL T4 PNK 5 μL 22 μL Totaal 90 μL 396 μL Tabel 1: Micro-C mastermix 1. Samenstelling van de mastermix voor de eindkauwreactie. Onderdelen 1x 4,4 keer 1 mM Biotine-dATP 10 μL 44 μL 1 mM Biotine-dCTP 10 μL 44 μL 10 mM mix van dTTP en dGTP 1 μL 4,4 μL 10x T4 DNA Ligase Buffer 5 μL 22 μL 200x BSA 0,25 μL 1,1 μL H2O 23,75 μL 104,5 μL Tabel 2: Micro-C mastermix 2. Samenstelling van de mastermix voor de eindetiketteringsreactie. Onderdelen 1x 4,4 keer 10x NEB T4 Ligase reactiebuffer 50 μL 220 μL H2O 422,5 μL 1859 μL T4 DNA-ligase 25 μL 110μL Tabel 3: Micro-C mastermix 3. Samenstelling van de mastermix voor de nabijheidsligatiereactie. Onderdelen 1x 4,4 keer 10x NEBuffer 1.1 20 μL 88 μL H2O 180 μL 792 μL ExoIII-nuclease 10 μL 44 μL Tabel 4: Micro-C mastermix 4. Samenstelling van het mastermengsel voor de biotineverwijderingsreactie.
Discussion
Het succes van een Micro-C-experiment hangt af van een paar cruciale stappen in het protocol die zorgvuldig moeten worden uitgevoerd. Ten eerste kan crosslinking met de extra crosslinker DSG of EGS leiden tot de aggregatie van cellen, afhankelijk van het celtype. Het toevoegen van 0,1%-0,5% BSA aan de verknopingsreactie vermindert de aggregatie aanzienlijk zonder de verknopingsefficiëntie te beïnvloeden. Inefficiënte verknoping kan leiden tot verhoogde percentages transchromosomale interacties die wijzen op willekeurige ligaties. De tweede, maar meest cruciale, stap in dit protocol is de vertering van chromatine met MNase. Suboptimale chromatinevertering leidt tot inefficiënte nabijheidsligatie (oververtering) of verhoogde snelheden van niet-nabijheidsgebonden dinucleosomen (ondervertering). De efficiëntie van de ligatiereactie kan worden geëvalueerd door middel van agarosegelelektroforese (Figuur 1B) en kan bovendien het best worden geschat door sequencing met een lage input. Als de sequentiebepaling met lage input een hoge duplicatiesnelheid (inefficiënte ligatie) of verhoogde di-nucleosoomsnelheden aan het licht brengt, moet de MNase-verteringsgraad opnieuw worden geëvalueerd. Met name het verlies van samples bij het uitvoeren van het protocol kan leiden tot een verminderde complexiteit van de bibliotheek. De concentratie van een monster kan het best worden geëvalueerd na DNA-zuivering (stap 5.3) of door minimale PCR (stap 8). De totale opbrengst van DNA van 5 x 106 zoogdiercellen na DNA-zuivering is doorgaans >2 μg. De DNA-concentratie moet worden gecontroleerd na de MNase-vertering, ExoIII-vertering en DNA-zuivering. Endogene nucleasen, waarvan de abundantie celtype-specifiek en soortspecifiek is, kunnen een bron van DNA-afbraak zijn. Bovendien kan DNA-zuivering op basis van kolommen leiden tot monsterverlies als gevolg van incompatibiliteit met het SDS door deproteïne-reacties. Ethanolneerslag kan worden overwogen als de DNA-concentratie bij deze stap laag is.
Aangezien Micro-C monsterspecifieke MNase-titratie vereist, is het een uitdaging om Micro-C toe te passen op kleine celpopulaties, zoals met kleine organen van verschillende modelorganismen, embryo’s en afzonderlijke cellen, organoïden of biopsieën van patiënten. Hier biedt Hi-C 3.0 een beproefd alternatief met behulp van een eindpuntreactie door sequentiespecifieke restrictie-endonucleases 8,9.
Micro-C is een breed toepasbare hoge-resolutie chromosoomconformatietechnologie met een hoog dynamisch bereik en een lage signaal-ruisverhouding, waardoor het bijzonder geschikt is voor het onderzoeken van korteafstandschromosoomkenmerken 4,5,8, zoals chromosoomlussen. De resolutie van Micro-C maakt het mogelijk om promotor-enhancer-lussen vast te leggen, die buiten de detectielimiet van Hi-C liggen, waardoor een meer gedetailleerde analyse van de relatie tussen genoomorganisatie en regulatie 13,14,15 efficiënt mogelijk wordt. Bovendien zijn onlangs DNA-capturestrategieën gecombineerd met Micro-C om de locusspecifieke resolutie van de beoogde genomische loci tot ongekende niveaus te verhogen, waardoor nieuwe inzichten in de ultrastructuur van het 3D-genoom aan het licht zijn gekomen16,17,18. Samenvattend stellen we ons voor dat Micro-C en zijn derivaten een sleuteltechnologie zullen zijn voor het ontleden van de rol van het 3D-genoom in transcriptieregulatie en, bijgevolg, differentiatie en onderhoud van celtypen.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Christl Gaubitz en Kathleen Stewart-Morgan voor hun kritische lezing van het manuscript. We danken Anja Groth en het Groth-lab voor hun steun bij het opzetten van ons lab. We danken de medewerkers van het CPR/reNEW Genomics Platform voor hun steun: H. Wollmann, M. Michaut en A. Kalvisa. Het Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW) wordt ondersteund door de Novo Nordisk Foundation subsidienummer NNF21CC0073729. Het Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research (CPR) wordt ondersteund door de Novo Nordisk Foundation subsidienummer NNF14CC0001. We danken het Brickman-lab van het Novo Nordisk Center for Stem Cell Medicine, reNEW Copenhagen, voor de ES-cellen van muizen.
Materials
| 1 mM Biotin dATP | Jenna Bioscience | NU-835-Bio14-S | |
| 1 mM Biotin dCTP | Jenna Bioscience | NU-809-BioX-S | |
| 10 mM dGTP | NEB | N0442S | |
| 10 mM dTTP | NEB | N0443S | |
| 10 U/ml T4 PNK | NEB | M0201L | |
| 100 U/L Exonuclease III | NEB | M0206L | |
| 10x NEBuffer 1.1 | NEB | B7001S | |
| 10x NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | |
| 10x T4 DNA Ligase buffer | NEB | B0202A | |
| 1x DPBS w/o Mg2+ and Ca2+ | ThermoFisher | 14190144 | |
| 1x LIF | |||
| 2_Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | 0.1 mM b-mercaptoethanol |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-500ML | Caution. See manufactures MSDS |
| 400 U/ml T4 DNA Ligase | NEB | M0202L | |
| 5 U/ml Klenow Fragment | NEB | M0210L | |
| Agarose | BIO-RAD | 1613102 | Caution. See manufactures MSDS |
| BSA 20mg/ml | NEB | B9000S | |
| CaCl2 | |||
| cell counter | |||
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D8418-100ML | Caution. See manufactures MSDS |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | refered to as: magnet magnet for 1.5 ml tubes |
| DynaMag-PCR Magnet | Invitrogen | 492025 | refered to as: magnet magnet for PCR tubes |
| EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | BioWorld | 40121266-1 | |
| Ethanol 96% | VWR Chemicals | 20824365 | quality control system |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | |
| Ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS) | ThermoFisher | 21565 | |
| Fetl Bovin Serum | Sigma Aldrich | F7524 | 15% FBS |
| Gel Loading dye purple (6X) | NEB | B7024S | |
| Glycine | PanReac AppliChem | A1067.0500 | |
| Halt Proteinase inhibitor (100x) | ThermoFisher | 78430 | Caution. See manufactures MSDS |
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | 18896-50ML | |
| MgCl 1 M | Invitrogen | AM9530G | |
| Micrococcal Nuclease (MNase) | Worthington | LS004798 | |
| mouse embryonic stem cells | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index primers) | NEB | E7600S | amplification primers for sequencing libraries |
| NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | NEB | E7645L | sequencing library preparation kit |
| NEBNext Ultra II Q5 Master mix | NEB | M0544S | Caution. See manufactures MSDS |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | 1x NEAA |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | 1% Pen-Strep |
| Proteinase K (40 mg/ml) | GoldBio | P-480-1 | Caution. See manufactures MSDS |
| QIAquick Gel extraction kit | QIAgen | 28706 | refered to as: DNA gel elution kit |
| QIAquick PCR purification kit | QIAgen | 28106 | refered to as: commercial DNA purification kit |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA quantification instrument |
| Quick load purple 1kb plus DNA Ladder | NEB | N0550S | |
| SPRIselect size selection beads | Beckman Coulter | B23319 | paramagnetic beads |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | refered to as: thermomixer |
| Tris | Merck | 10708976001 | |
| Trypsin | |||
| Tween20 | Sigma Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrapure 10% SDS | Invitrogen | 15553-035 | |
| Ultrapure Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol (PCI) | Invitrogen | 15593-031 | |
| Fragment Analyzer |
Referências
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Hsieh, T. -. H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. Micro-C XL: Assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome. Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).
- Hsieh, T. -. H. S., et al. Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C. Cell. 162 (1), 108-119 (2015).
- Krietenstein, N., et al. Ultrastructural details of mammalian chromosome architecture. Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).
- Hsieh, T. -. H. S., et al. Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding. Molecular Cell. 78 (3), 539-553 (2020).
- Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation. Methods. 123, 56-65 (2017).
- van Holde, K. E. . Chromatin. , (1989).
- Oksuz, B. A. Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays. Nature Methods. 18, 1046-1055 (2021).
- Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 3.0: Improved protocol for genome-wide chromosome conformation capture. Current Protocols. 1 (7), 198 (2021).
- Goloborodko, A., Venev, S., Abdennur, N., Di Tommaso, P. Mirnylab/distiller-nf; v033. Zenodo. , (2019).
- Venev, S., et al. Open2c/cooltools: v0.4.1. Zenodo. , (2021).
- Abdennur, N., Mirny, L. A. Cooler: Scalable storage for Hi-C data and other genomically labeled arrays. Bioinformatics. 36 (1), 311-316 (2019).
- Zhang, S., Übelmesser, N., Barbieri, M., Papantonis, A. Enhancer-promoter contact formation requires RNAPII and antagonizes loop extrusion. BioRxiv. , (2022).
- Barshad, G., et al. RNA polymerase II and PARP1 shape enhancer-promoter contacts. BioRxiv. , (2022).
- Hansen, A. S., et al. Distinct classes of chromatin loops revealed by deletion of an RNA-binding region in CTCF. Molecular Cell. 76 (3), 395-411 (2019).
- Hua, P., et al. Defining genome architecture at base-pair resolution. Nature. 595 (7865), 125-129 (2021).
- Downes, D. J. High-resolution targeted 3C interrogation of cis-regulatory element organization at genome-wide scale. Nature Communications. 12, 531 (2021).
- Goel, V. Y., Huseyin, M. K., Hansen, A. S. Region capture Micro-C reveals coalescence of enhancers and promoters into nested microcompartments. BioRxiv. , (2022).
Citar este artigo
Metelova, M., Jensen, R. R., Krietenstein, N. Mapping Mammalian 3D Genome Interactions with Micro-C-XL. J. Vis. Exp. (201), e64579, doi:10.3791/64579 (2023).