Micro-C-XL을 사용한 포유류 3D 게놈 상호 작용 매핑

1. 세포 배양 및 가교 실험에 따른 배양 세포는 최소 1 x 107 세포를 얻을 필요가 있다. 여기에서, 세포는 E14 배지 (피루브산 및 L- 글루타민을 함유 한 DMEM, 15 % FBS, 1x LIF, 1x NEAA, 1 % 펜 – 스트렙, 0.1 mM β- 메르캅토 에탄올 [재료 표 참조])에서 5 % CO 2로 37 °C에서 성장시키고2 일마다 통과시켰다.참고: 이 프로토콜은 호모 사피엔스(Homo sapien) 및 무스 무스큘러스(Mus musculus)와 같은 여러 종의 다양한 세포 유형에 성공적으로 적용되었습니다. 이 예에서는 마우스 배아 줄기(ES) 세포를 사용했습니다. 배지를 흡인하여 70%-80% 밀도로 세포를 수확합니다. 5mL의 DPBS로 한 번 세척하고 37°C에서 2-3분 동안 10cm 접시당 3mL의 예열된 0.25% 트립신으로 세포를 배양합니다. 예열된 E14 배지 7mL로 트립신을 퀀칭하고 분리된 세포를 50mL 튜브로 옮깁니다. 실온(RT)에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 배지에 재현탁시킵니다. 셀 카운터로 셀을 계산합니다.참고 프로토콜은 세포 농도의 일부 변화에 강하며 세포 수를 정량화하기 위해 다양한 세포 카운터가 사용되었습니다. 그러나 사용되는 셀 카운터의 동적 범위를 알고 있어야 합니다. 이것은 일반적으로 1 x 105-1 x 107 cells/mL 사이입니다. 이 세포 유형에 대해 원심분리 속도와 지속 시간을 테스트했지만 다른 작은 세포는 더 높은 원심분리 속도 또는 더 긴 탈수 시간이 필요할 수 있으며 그에 따라 원심분리를 조정해야 합니다. RT에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 세포를 수집하고 1 x 106 cells/mL의 최종 농도에서 DPBS에 세포를 재현탁시킵니다. 예를 들어, 수율이 1 x 107 세포인 경우 세포를 10mL의 DPBS에 재현탁시킵니다. 첫 번째 가교 단계의 경우, 37 % 포름 알데히드 (FA)를 세포 현탁액에 1 %의 최종 농도로 첨가하고, 회전 (15-20 rpm)으로 RT에서 10 분 동안 세포 현탁액을 배양합니다. 예를 들어, 수율이 1 x 107 세포인 경우 10mL 세포 현탁액에 270μL의 FA를 추가합니다.알림: FA 용액은 일반적으로 개봉 후 최대 3개월 동안 RT에서 안정적입니다. 최종 농도 0.25M에 2.5M 글리신을 첨가하여 반응을 소멸시키고 회전(15-20rpm)으로 RT에서 5분 동안 배양합니다. 예를 들어, 수율이 1 x 107 세포인 경우 세포 현탁액에 1.027mL의 2.5M 글리신을 추가합니다. RT에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 세포를 수집합니다. 상층액을 버리고 5mL의 DPBS에 세포를 재현탁시킵니다. 원심분리 단계를 한 번 반복하고 펠릿화된 세포를 DPBS에 4 x 106 cells/mL로 재현탁시킵니다. 예를 들어, 수율이 1 x 107 세포인 경우 세포를 2.5mL의 DPBS에 재현탁시킵니다. 두 번째 가교 단계의 경우, DMSO에서 에틸렌 글리콜 비스-숙시니미딜 숙시네이트(EGS) 0.3M 원액을 준비합니다(DMSO 100μL에 EGS 13.6mg). 최종 농도 3mM의 EGS를 세포 현탁액에 첨가하고, 회전(15-20 rpm)으로 40분 동안 실온에서 배양합니다. 예를 들어, 수율이 1 x 107 세포인 경우 25μL의 0.3M EGS 원액을 2.5mL의 세포 현탁액에 추가합니다.알림: 원액을 준비하기 위해 계량하기 전에 최소 20분 동안 EGS를 RT로 평형화합니다. 최종 농도 0.4M에 2.5M 글리신을 첨가하여 반응을 소멸시키고 회전(15-20rpm)으로 RT에서 5분 동안 배양합니다. 예를 들어, 수율이 1 x 107 세포인 경우 세포 현탁액에 400μL의 2.5M 글리신을 추가합니다. RT에서 5분 동안 1,000 x g에서 원심분리하여 세포를 수집하고, 펠릿화된 세포를 DPBS에서 5 x 106 cells/mL로 재현탁시킵니다. 분취용 라이브러리용 5 x 10 6 cells/tube와 MNase 분해를 위한 적정용 1 x 106 cells/tube를 분배합니다.참고: 각 가교 세포 배치에 대해 최적의 분해도를 적정하는 것이 좋습니다. 이상적으로는 MNase 적정 실험(2단계)을 위해 1 x 106 세포의 2-3개 부분 표본을 수집하고, 분취 실험(3단계)을 위해 5 x 106 세포의 부분 표본 2-4개를 수집합니다. RT에서 5분 동안 1,000 x g 에서 원심분리하여 세포를 수집하고 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 액체 질소에 스냅 얼린 후 -80°C에서 보관합니다.참고: 성공적인 Micro-C 라이브러리는 최대 3개월 동안 보관된 샘플에서 준비할 수 있습니다. 2. MNase 적정 참고: 이중 가교 세포의 분취 라이브러리를 처리하기 전에 MNase의 최적 농도를 결정하기 위해 MNase 적정을 수행해야 합니다. MNase 적정을 수행하려면 얼음 위에서 1 x 106 세포의 펠릿 1개를 10분 동안 해동하고 세포를 500μL의 DPBS에 재현탁시킵니다(세포가 벽에 달라붙으면 1x BSA 추가). 세포 현탁액을 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. RT에서 5분 동안 10,000 x g에서 원심분리하여 세포를 수집하고 상층액을 제거합니다. 펠릿화된 세포를 500μL의 MB#1 완충액(50mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 5mM MgCl2, 1mMCaCl2, 0.2% NP-40, 1x 프로테아제 억제제[재료 표 참조], pH 7.4)에 재현탁시킵니다. 10,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고 상층액을 제거합니다. 200μL의 MB#1 완충액에 세포를 재현탁시키고 샘플을 4개의 튜브로 분할합니다. MNase (20 U / μL)의 한 바이알을 해동하고 10 : 2, 1 : 4, 1 : 4 및 1 : 4의 연속으로 10 mM Tris, pH 7.4로 희석하여 각각 10 U / μL, 2.5 U / μL, 0.625 U / μL 및 0.1256 U / μL (각 분해 조건에 대해 하나씩). 적절한 시간 간격(10-20초)으로 1μL의 MNase 용액을 4개의 샘플 중 하나인 와류에 추가하고 37°C의 열혼합기에서 10분(800rpm 진탕) 동안 배양합니다. 나머지 MNase 희석액에서 1μL를 나머지 세포 부분 표본에 계속 추가합니다. 200 μL의 갓 준비된 STOP 완충액 (10 mM Tris의 150 μL, pH 7.4, 10 % SDS의 25 μL, 20 mg / mL proteinase K의 25 μL, 0.5 M EGTA의 2 μL)을 MNase가 첨가 된 동일한 순서와 동일한 시간 간격으로 각 튜브에 첨가하여 Mnase 분해를 중지하십시오. 65 °C에서 2 시간 동안 배양합니다. 각 샘플에 500μL의 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(PCI)을 추가하고 볼텍싱으로 완전히 혼합합니다. 상온에서 5분 동안 19,800 x g 에서 원심분리하여 상을 분리하고 수성상을 새 튜브(약 200μL/샘플)로 옮깁니다.주의: PCI에는 수많은 독성 성분이 포함되어 있으므로 화학 안전 후드를 착용한 상태에서만 취급해야 합니다. 자세한 내용은 제조업체에 문의하십시오. 제조업체의 지침에 따라 상용 DNA 정제 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 DNA를 정제하고 12μL의 용출 완충액에서 샘플을 용리합니다.참고: 탈단백질화 단계(2.5단계)의 SDS 농도는 일부 DNA 정제 키트에 대해 억제됩니다. 여기에 사용된 DNA 정제 키트는 에탄올 침전과 유사한 성능을 발휘합니다. 2-5 μL의 로딩 염료를 첨가하고 120 V의 1.5 % 아가로스 겔에서 30-50 분 동안 샘플을 실행합니다 (적절하게 분리 될 때까지; 그림 1A). 실험에 가장 적합한 분해 정도를 선택하고 분취용 MNase 분해를 계속합니다. 최적의 분해도는 핵하 분절이 거의 또는 전혀 없고 70%-90% 단핵체 대 디뉴클레오솜 비율을 나타냅니다.참고: 이 실험에서, 도 1A에서 레인 4의 분해도는 2.5 x 10 5 세포에 대해 0.625-1.25 U의 Mnase로 얻어진 최적의 분해로 결정되었다(= 1 x 106 세포에 대해 2.5-5 U의 Mnase). 자세한 내용은 대표 결과를 참조하십시오. 3. 분취용 MNase 분해 MNase 분해를 통해 염색질을 단뉴클레오솜으로 단편화하려면 이전에 이중 가교된 5 x 106 세포 부분 표본을 해동하고 1mL의 DPBS에 재현탁합니다. 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다(세포가 튜브 벽에 달라붙으면 BSA 1개 추가). RT에서 5분 동안 10,000 x g 에서 원심분리하여 세포를 수집하고 상층액을 버린다. 펠릿을 500μL의 MB#1 완충액에 재현탁시킵니다. 원심분리 단계를 한 번 반복합니다. 펠릿을 1mL의 MB#1 완충액에 재현탁시키고 200μL 부분 표본(부분 표본당 1 x 106 세포)을 만듭니다. MNase 적정(2단계에서 설명)을 기반으로 각 부분 표본에 적절한 양의 MNase(일반적으로 1 x 106 세포당 2.5-10 U/μL)를 첨가하여 크로마틴을 분해합니다. 잘 섞고(와류 및 빠르게 회전) 37°C의 열혼합기에서 800rpm 흔들면서 10분 동안 배양합니다. 각 부분 표본에 1.6μL의 0.5M EGTA(최종 4mM)를 추가하여 MNase 분해를 중지하고 65°C의 열혼합기에서 800rpm 진탕으로 10분 동안 배양합니다. RT에서 5분 동안 10,000 x g 에서 원심분리하여 샘플을 수집하고 상층액을 버립니다. 셀 펠릿을 500μL의 1x NEBuffer 2.1에 재현탁시킵니다. 추가 처리를 위해 5 x 106 셀 이하의 입력에 해당하는 샘플을 풀링합니다.참고: 5 x 106 세포 이상을 처리해야 하는 경우 효소 조건이 5 x 106 세포에 최적화되어 있으므로 이러한 샘플을 병렬로 처리하십시오. 근접 연결 단계를 진행하기 전에 샘플의 10%를 MNase 분해 수준을 제어하기 위한 입력 대조군으로 전송합니다. 이 샘플에 150 μL의 10 mM Tris, pH 7.4, 25 μL의 10 % SDS 및 25 μL의 20 mg / mL proteinase K를 첨가하고 65 ° C에서 밤새 배양합니다. 4. DNA 말단 처리 및 근접 결찰 남은 시료는 4°C에서 5분 동안 10,000 x g 에서 원심분리하여 수집하고, 상층액은 버린다. 펠릿을 90μL의 갓 준비한 Micro-C 마스터 믹스 1(표 1)에 재현탁시키고 800rpm 진탕으로 37°C에서 15분 동안 열혼합기에서 배양합니다. 10μL의 5U/μL Klenow Fragment를 추가하고 800rpm 진탕으로 37°C에서 15분 동안 열혼합기에서 배양합니다. 갓 준비한 Micro-C 마스터 믹스 2 100μL(표 2)를 추가하고 25°C에서 800rpm 진탕으로 45분 동안 열혼합기에서 배양합니다. 배양 후 EDTA를 최종 농도 30mM로 첨가하여 효소 반응을 소멸시킵니다. 65°C에서 800rpm으로 진탕하여 20분 동안 열혼합기에서 배양합니다. 4°C에서 5분 동안 10,000 x g 에서 원심분리하여 샘플을 수집하고 상층액을 버립니다. 샘플을 500μL의 갓 준비한 Micro-C 마스터 믹스 3(표 3)에 재현탁시키고 회전(15-20rpm)과 함께 RT에서 2.5시간 동안 배양합니다. 4°C에서 5분 동안 10,000 x g 에서 원심분리하여 샘플을 수집하고 상층액을 버립니다. 샘플을 200μL의 갓 준비한 Micro-C 마스터 믹스 4(표 4)에 재현탁시키고 37°C에서 800rpm 진탕으로 15분 동안 열혼합기에서 배양합니다. 역교차결합 및 탈단백질화를 위해 25μL의 20mg/mL proteinase K와 25μL의 10% SDS를 샘플에 추가하고 간헐적 혼합으로 65°C에서 밤새 배양합니다. 5. 디뉴클레오솜 DNA 정제 및 크기 선택 500 μL의 PCI를 샘플 및 입력 컨트롤에 추가하고 볼텍싱으로 혼합합니다. 19,800 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 상을 분리하고 상부 수성상을 새 튜브로 옮깁니다. DNA 정제 키트를 사용하거나 에탄올 침전을 통해 DNA를 농축합니다. 샘플을 30μL(5.3단계)로 용리하고 입력 대조군(3.11단계)을 15μL로 용리하고 1.5% 아가로스 겔을 실행하여 단핵소체와 디뉴클레오솜을 분리합니다(그림 1B).참고: 탈단백질화 단계의 SDS 농도는 일부 DNA 정제 키트에 대해 억제됩니다. 여기에 사용된 DNA 정제 키트( 재료 표 참조)는 에탄올 침전과 유사한 성능을 발휘합니다. 사용된 셀 수에 따라 입력 범위는 100ng에서 10μg입니다. 일반적으로 1-5μg의 DNA가 5 x 106 세포에서 추출됩니다. 디뉴클레오솜 크기(약 300bp)를 가진 DNA 단편을 절제합니다. 시중에서 판매되는 DNA 겔 용출 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 아가로스 겔에서 DNA를 추출하고 150μL에서 용리합니다. 6. 스트렙타비딘 비드의 제조 샘플당 10μL의 streptavidin 비드( 재료 표 참조)를 반응 튜브로 옮깁니다. 1.5mL 튜브에 적합한 자석에 넣습니다( 재료 표 참조). 용액이 맑아진 후(1-2분) 상층액을 제거하고 샘플당 300μL의 1x TBW(5mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5mM EDTA, 1M NaCl, 0.05% 트윈 20)에 비드를 재현탁시킵니다. 이 단계를 한 번 반복합니다. 7 단계에서 처리 된 샘플 당 150 μL의 2x B &W 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl)에 비드를 재현탁시킵니다. 7. Streptavidin 풀다운 및 온비드 라이브러리 준비 150μL의 사전 준비된 비드(단계 6.3)를 샘플 150μL(단계 5.3)에 추가합니다. 회전(15-20 rpm)과 함께 RT에서 20분 동안 배양합니다. 튜브를 적절한 자석에 넣고 용액이 맑아질 때까지 기다립니다(1-2분). 상층액을 제거하고 비드를 300μL의 1x TBW에 재현탁시킵니다. 이 단계를 반복합니다. 튜브를 적절한 자석에 놓고 용액이 맑아질 때까지 기다립니다(1-2분). 상층액을 제거하고 비드를 0.1x TE (1mM Tris, 0.1mM EDTA, pH 8.0)의 100μL에 재현탁시킵니다. 튜브를 적절한 자석에 놓고 용액이 맑아질 때까지 기다립니다(1-2분). 상층액을 제거하고 비드를 50μL의 0.1x TE에 재현탁시킨 다음 PCR 튜브로 옮깁니다.참고: 사용된 0.1x TE의 부피(50μL)는 이 프로토콜에 사용된 DNA 염기서열 분석 라이브러리 준비 키트( 재료 표 참조)의 입력 부피에 해당합니다. 다른 키트나 전략을 사용하는 경우 그에 따라 볼륨을 조정하십시오. 제조업체의 프로토콜에 따라 염기서열분석 라이브러리 준비 키트의 DNA 조작 단계를 수행합니다. 이러한 단계에는 일반적으로 DNA 둔화, A-tailing, 어댑터 결찰 및 U 절제가 포함됩니다. 마지막 단계(U 절제)는 이 연구에 사용된 키트에 따라 다릅니다. 해당 키트를 사용하는 경우 희석되지 않은 어댑터를 사용하여 키트 프로토콜의 1단계에서 2.6단계까지 제조업체의 지침을 따르고 2.6단계 이후 -20°C 보관을 고려하지 마십시오.참고: 염기서열분석 키트에 필요한 완충액 변화는 DNA가 여전히 스트렙타비딘 비드에 결합되어 있기 때문에 비드를 자석에 결합하고 세척하여 교환해야 합니다(7.3-7.4단계). 또한 DNA가 마그네틱 비드에 결합되어 있기 때문에 키트 프로토콜에서 어댑터 결찰 후 정제 및 크기 선택 단계를 무시하십시오. 7.6단계(이 프로토콜)를 계속 진행합니다. 어댑터 결찰이 완료된 후 7.2단계에서 설명한 대로 샘플을 세척합니다. 상층액을 버리고 비드를 20μL의 0.1x TE에 재현탁시킵니다. 8. 필요한 PCR 주기의 추정 참고: 라이브러리 증폭에 필요한 PCR 주기를 추정하는 것이 좋습니다. 일반적으로 Micro-C 라이브러리에는 8-15 주기의 PCR이 필요합니다. 이 단계가 필수는 아니지만 과증폭을 방지하고 PCR 중복의 위험을 줄이는 데 도움이 됩니다. 필요한 최소 PCR 주기 수를 정의하려면 1μL의 스트렙타비딘-비오틴-DNA 샘플로 PCR을 수행합니다(단계 7.6). 이를 위해 PCR 마스터 믹스(3.2μL의 H2O, 0.4μL의 i5 프라이머, 0.4μL의 i7 프라이머 및 5μL의 Q5 고충실도 DNA 중합효소)를 샘플에 추가합니다. 사용된 DNA 라이브러리 준비 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 16주기로 PCR을 수행합니다.참고: 여기에 사용된 프라이머는 사용된 라이브러리 준비 키트와 호환되어야 하는 별도의 키트( 재료 표 참조)로 구입한 것입니다. PCR 후 적절한 자석으로 비드를 채취하고 고감도 DNA 정량화 기기를 사용하여 상층액 1μL의 DNA 농도를 측정합니다( 재료 표 참조). 총 DNA 농도를 얻으려면 이 값에 10(PCR 반응의 총 부피)을 곱합니다. 대표 결과에서 논의된 바와 같이 필요한 PCR 주기 수를 추정합니다. 나머지 9μL의 PCR 혼합물에 2μL의 6x 로딩 버퍼를 추가합니다. 1% 아가로스 겔에서 PCR 증폭 라이브러리를 분해하여 성공적인 어댑터 결찰을 결정하면 약 450bp 크기가 됩니다(그림 1C).알림: 젤은 약 420bp(Micro-C 라이브러리 및 어댑터)의 뚜렷한 밴드를 보여야 합니다. 120bp의 대역은 어댑터 이량체를 나타내며 복잡성이 낮은 라이브러리를 나타냅니다. 더 낮은 분자량의 밴드가 나타날 수 있으며(100bp 미만), 이는 PCR 반응에서 사용되지 않은 프라이머입니다. 9. 염기서열분석 라이브러리 증폭 PCR 마스터 믹스(H2O65μL, Q5 고충실도 DNA 중합효소 100μL, i5 프라이머 8μL, i7 프라이머 8μL)를 나머지 19μL의 스트렙타비딘-비오틴-DNA 샘플에 추가합니다. 반응 혼합물을 50-100 μL 부분 표본으로 분할합니다.참고: PCR의 최적 부피는 PCR 기계에 따라 다릅니다. 일반적으로 50μL는 일반 PCR 기계에서 가장 재현성 있는 증폭을 제공합니다. 8단계에서 결정된 사이클 수로 DNA 라이브러리 준비 키트의 제조업체 지침에 따라 PCR을 수행합니다. 단계 8을 생략한 경우, PCR에 대해 14 사이클을 권장합니다. 상자성 비드( 재료 표 참조)로 제조업체의 프로토콜에 따라 1:0.9의 비율로 DNA를 정제합니다. 0.1% TE의 20μL에서 용리합니다.알림: 8.5단계에서 어댑터 이량체가 감지되면 동일한 비율을 사용하여 두 번 정제를 수행하십시오. DNA 농도를 측정하고 품질 관리 시스템에서 샘플을 실행합니다( 재료 표 참조). 단일 정밀 대역의 존재로 Micro-C 라이브러리의 우수한 품질을 보장합니다(그림 1D).참고: 어댑터 이량체는 PCR 전에 시료를 세척하기 때문에 on-bead 라이브러리 준비에서 일반적이지 않습니다. 따라서 어댑터 이량체의 모양은 라이브러리 복잡성이 낮다는 것을 나타냅니다. 어댑터 이량체가 관찰되면 낮은 입력 시퀀싱으로 샘플의 품질을 관리하는 것이 좋습니다. 10. DNA 염기서열 분석 및 데이터 처리 Micro-C 라이브러리를 염기서열분석 공급자의 요구 사항에 따라 paired-end 염기서열분석으로 시퀀싱합니다.참고: 이상적으로, 샘플은 읽기당 50bp의 paired-end 모드의 플랫폼에서 시퀀싱됩니다. 2 x 35bp와 같이 더 짧은 읽기 길이를 제공하는 이전 플랫폼도 성공적으로 사용되었습니다. 중요한 것은 반복적인 게놈 영역을 연구하는 경우 더 긴 판독 길이로 염기서열을 분석하는 것이 좋습니다. Micro-C 라이브러리의 품질을 평가하려면 샘플당 5 x 106 – 1 x 107 read로 낮은 입력 시퀀싱을 수행합니다. Distiller10을 사용하여 시퀀싱 파일(fastq 파일)을 처리합니다. 적절한 참조 게놈(여기서는 mm10)에 대해 판독을 매핑합니다.참고: 시퀀싱 파일은 로컬 컴퓨터 또는 컴퓨팅 클러스터에서 다양한 파이프라인을 사용하여 처리할 수 있습니다. 염기서열분석 깊이가 낮은 샘플의 경우 10,000bp, 50,000bp, 100,000bp 및 500,000bp와 같이 빈 크기가 크면 컴퓨팅 요구와 파일 크기를 줄일 수 있습니다. Distiller(이 연구에서 사용됨)는 Micro-C 라이브러리의 품질을 평가하는 데 필요한 모든 파일 형식을 생성합니다. 생성된 *.stats 파일에는 맵 속도, cis-trans 비율 및 읽기 쌍 사이의 거리로 계층화된 읽기 방향에 대한 정보가 포함되어 있습니다. 이러한 파라미터는 그림 2에 시각화되어 있으며, Micro-C 라이브러리 품질 평가는 대표적인 결과에서 논의됩니다. 프로세싱 소프트웨어는 또한 상호 작용 매트릭스(9)를 생성하기 위해 HiGlass(https://docs.higlass.io/)에 직접 로드할 수 있는 mcool 파일을 생성합니다.