Cartographie des interactions du génome 3D des mammifères avec Micro-C-XL
Summary
Un protocole de cartographie de l’organisation tridimensionnelle du génome avec la résolution des nucléosomes à l’aide de la méthode de capture de conformation chromosomique à l’échelle du génome Micro-C-XL est présenté ici.
Abstract
L’organisation tridimensionnelle (3D) des chromosomes est un facteur majeur dans la régulation du génome et la spécification du type cellulaire. Par exemple, on pense que les éléments cis-régulateurs, connus sous le nom d’amplificateurs, régulent l’activité des promoteurs distaux via l’interaction dans l’espace 3D. Les technologies de capture de conformation chromosomique (3C) à l’échelle du génome, telles que Hi-C, ont transformé notre compréhension de la façon dont les génomes sont organisés dans les cellules. La compréhension actuelle de l’organisation du génome en 3D est limitée par la résolution avec laquelle l’organisation topologique des chromosomes dans l’espace 3D peut être résolue. Micro-C-XL mesure le repliement des chromosomes avec une résolution au niveau du nucléosome, l’unité de base de la chromatine, en utilisant la nucléase micrococcique (MNase) pour fragmenter les génomes pendant le protocole de capture de conformation chromosomique. Il en résulte une amélioration du rapport signal/bruit dans les mesures, facilitant ainsi une meilleure détection des sites d’isolation et des boucles chromosomiques par rapport à d’autres technologies 3D à l’échelle du génome. Un protocole visuellement détaillé, étape par étape, pour la préparation d’échantillons Micro-C-XL de haute qualité à partir de cellules de mammifères est présenté dans cet article.
Introduction
Micro-C-XL est une technique à l’échelle du génome permettant de mesurer la conformation du génome en 3D avec une résolution de nucléosome. Micro-C-XL s’appuie sur la technologie Hi-C basée sur la ligature de proximité largement utilisée, qui a transformé notre compréhension de l’organisation des génomes 3D1. Micro-C-XL et sa première itération, Micro-C, ont été initialement développés dans Saccharomyces cerevisiae2,3 et ont ensuite été adaptés aux systèmes cellulaires de mammifères, pour lesquels le protocole a démontré tout son potentiel dans la détection de caractéristiques à courte portée du génome 3D, telles que les boucles chromosomiques et les sites d’isolation. Cette version est basée sur des publications récentes sur les mammifères Micro-C-XL 4,5. Comme Micro-C-XL remplace Micro-C, Micro-C-XL est désormais appelé Micro-C dans le manuscrit.
Les principales différences entre Micro-C et Hi-C6 sont les suivantes : 1) fragmentation du génome avec la nucléase micrococcique (MNase) par rapport aux enzymes de restriction et 2) réticulation supplémentaire avec un espacement atomique plus grand entre les groupes réactifs par rapport au formaldéhyde seul. Ces deux étapes contribuent de manière significative à l’amélioration du rapport signal/bruit du Micro-C par rapport au Hi-C conventionnel. La taille de la fragmentation limite la résolution à laquelle l’organisation du génome 3D peut être résolue au cours du protocole de ligature de proximité. La MNase est une nucléase qui digère préférentiellement l’ADN accessible et laisse intact l’ADN protégé par le nucléosome. L’empreinte des nucléosomes à l’aide du séquençage MNase a montré que les nucléosomes recouvrent entièrement la plupart des génomes eucaryotes7. Comme les nucléosomes sont distribués dans tout le génome avec un espacement moyen de 160 à 220 pb, selon l’espèce et le type de cellule, la MNase est l’enzyme idéale pour la cartographie à haute résolution de l’architecture du génome.
L’utilisation d’un agent de réticulation supplémentaire en combinaison avec du formaldéhyde (FA) dans la méthode Micro-C améliore en outre le rapport signal/bruit 2,8. Les agents de réticulation spécifiques aux amines avec des espaceurs atomiques plus longs entre les groupes réactifs facilitent les réticulations protéine-protéine. Il s’agit généralement de glutarate de disuccinimidyle (DSG) ou de succinium bis-succinimidyle d’éthylène glycol (EGS) avec des entretoises de 7,7 Å et 16,1 Å, respectivement. La réduction du bruit par l’EGS ou le DSG est particulièrement apparente dans les expériences avec des taux de fragmentation élevés, tels que Micro-C, et se produit probablement en raison d’une réduction du taux d’événements de ligature aléatoires8.
Un protocole Hi-C 3.0 récemment développé qui utilise la réticulation ESG/DSG et de multiples combinaisons d’enzymes de restriction réduit le bruit dans les expériences Hi-C et améliore considérablement la détection des boucles chromosomiques et des sites d’isolation 8,9. Néanmoins, une comparaison site par site de diverses caractéristiques des données d’interaction a révélé que Micro-C avait une détection supérieure des caractéristiques à courte portée, telles que les boucles chromosomiques et les sites d’isolation, par rapport à Hi-C 3.0 et Hi-C8 conventionnel. Cependant, Hi-C 3.0 améliore la détection des caractéristiques à courte portée et maintient une forte détection de la compartimentation du génome par rapport à Hi-C conventionnel. En résumé, le choix d’une méthode de capture de conformation chromosomique doit être déterminé par la question objective et biologique.
Ici, nous fournissons un protocole étape par étape pour des expériences Micro-C réussies qui peuvent démêler l’organisation du génome 3D.
Protocol
1. Culture cellulaire et réticulation Cellules de culture selon les besoins expérimentaux pour obtenir un minimum de 1 x 107 cellules. Ici, les cellules ont été cultivées à 37 °C avec 5 % de CO2 dans un milieu E14 (DMEM avec pyruvate et L-glutamine, 15 % de FBS, 1 x LIF, 1 x NEAA, 1 % de prococtocoque de stylo, 0,1 mM de β-mercaptoéthanol [voir le tableau des matériaux]) et passées tous les deux jours.REMARQUE : Ce protocole a été appliqué avec succès à divers types de cellules de plusieurs espèces, telles que Homo sapiens et Mus musculus. Dans cet exemple, des cellules souches embryonnaires (ES) de souris ont été utilisées. Récoltez les cellules à 70 % à 80 % de confluence en aspirant le milieu. Laver une fois avec 5 mL de DPBS et incuber les cellules avec 3 mL de trypsine préchauffée à 0,25 % par boîte de 10 cm pendant 2-3 min à 37 °C. Tremper la trypsine avec 7 mL de milieu E14 préchauffé et transférer les cellules détachées dans un tube de 50 mL. Granuler les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à température ambiante (RT). Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules.NOTE Le protocole est robuste à certaines variations des concentrations cellulaires, et divers compteurs de cellules ont été utilisés pour quantifier le nombre de cellules ; Cependant, soyez conscient de la plage dynamique du compteur de cellules utilisé. C’est généralement entre 1 x 105-1 x 107 cellules/mL. Bien que la vitesse et la durée de centrifugation aient été testées pour ce type de cellule, différentes cellules plus petites peuvent nécessiter une vitesse de centrifugation plus élevée ou des temps d’essorage plus longs, et la centrifugation doit être ajustée en conséquence. Prélever les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à RT et remettre les cellules en suspension dans du DPBS à une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL. Par exemple, si le rendement est de 1 x 107 cellules, remettre les cellules en suspension dans 10 mL de DPBS. Pour la première étape de réticulation, ajouter 37 % de formaldéhyde (AG) à une concentration finale de 1 % dans la suspension cellulaire, et incuber la suspension cellulaire pendant 10 min à RT avec rotation (15-20 tr/min) ; Par exemple, si le rendement est de 1 x 107 cellules, ajoutez 270 μL d’AG à la suspension cellulaire de 10 mL.REMARQUE : La solution FA est généralement stable à RT jusqu’à 3 mois après ouverture. Tremper la réaction en ajoutant 2,5 M de glycine à une concentration finale de 0,25 M et incuber pendant 5 min à RT avec rotation (15-20 tr/min). Par exemple, si le rendement est de 1 x 107 cellules, ajoutez 1,027 mL de glycine 2,5 M à la suspension cellulaire. Prélever les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à RT. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 5 mL de DPBS. Répétez l’étape de centrifugation une fois et remettez en suspension les cellules granulées dans le DPBS à 4 x 106 cellules/mL. Par exemple, si le rendement est de 1 x 107 cellules, remettre les cellules en suspension dans 2,5 mL de DPBS. Pour la deuxième étape de réticulation, préparer une solution mère de 0,3 M de succinate d’éthylène glycol bis-succinimidyle (EGS) dans du DMSO (13,6 mg d’EGS dans 100 μL de DMSO). Ajouter l’EGS à une concentration finale de 3 mM à la suspension cellulaire et incuber à RT pendant 40 min avec rotation (15-20 tr/min). Par exemple, si le rendement est de 1 x 107 cellules, ajouter 25 μL de solution mère d’EGS à 0,3 M à 2,5 mL de la suspension cellulaire.REMARQUE : Équilibrer l’EGS à RT pendant au moins 20 minutes avant de peser pour préparer la solution mère. Tremper la réaction en ajoutant 2,5 M de glycine à une concentration finale de 0,4 M, et incuber pendant 5 min à RT avec rotation (15-20 tr/min). Par exemple, si le rendement est de 1 x 107 cellules, ajoutez 400 μL de glycine 2,5 M à la suspension cellulaire. Prélever les cellules par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min à RT, et remettre en suspension les cellules granulées dans du DPBS à 5 x 106 cellules/mL. Distribuer 5 x 10 6 cellules/tube pour les banques préparatives et 1 x 106 cellules/tube pour le titrage pour la digestion de la MNase.REMARQUE : Il est suggéré de titrer le degré de digestion optimal pour chaque lot de cellules réticulées. Idéalement, prélever deux à trois aliquotes de 1 x 106 cellules pour les expériences de titrage MNase (étape 2) et deux à quatre aliquotes de 5 x 106 cellules pour les expériences préparatoires (étape 3). Prélever les cellules par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min à RT et retirer le surnageant. Congelez les granulés cellulaires dans de l’azote liquide et stockez-les à −80 °C.REMARQUE : Les bibliothèques Micro-C réussies peuvent être préparées à partir d’échantillons stockés jusqu’à 3 mois. 2. Titrage MNase REMARQUE : L’exécution d’un titrage de MNase est nécessaire pour déterminer la concentration optimale de MNase avant de traiter la bibliothèque préparative des cellules réticulées. Pour effectuer le titrage MNase, décongeler une pastille de 1 x 106 cellules sur de la glace pendant 10 min et remettre les cellules en suspension dans 500 μL de DPBS (ajouter 1x BSA si les cellules collent à la paroi). Incuber la suspension cellulaire sur de la glace pendant 20 min. Prélever les cellules par centrifugation à 10 000 x g pendant 5 min à RT, et retirer le surnageant. Remettre les cellules en granulés dans 500 μL de tampon MB#1 (50 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 5 mM de MgCl 2, 1 mM de CaCl 2,0,2 % de NP-40, 1x inhibiteur de protéase [voir le tableau des matériaux], pH 7,4). Prélever les cellules par centrifugation à 10 000 x g pendant 5 min, et retirer le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon MB#1 et diviser l’échantillon en quatre tubes. Décongeler un flacon de MNase (20 U/μL) et le diluer avec 10 mM de Tris, pH 7,4, en séries de 1 :2, 1 :4, 1 :4 et 1 :4 pour obtenir des concentrations de 10 U/μL, 2,5 U/μL, 0,625 U/μL et 0,1256 U/μL respectivement (un pour chaque condition de digestion). Avec des intervalles de temps appropriés (10-20 s), ajouter 1 μL de solution de MNase à l’un des quatre échantillons, vortex, et incuber sur un thermomélangeur à 37 °C pendant 10 min (agitation de 800 tr/min). Continuer en ajoutant 1 μL des dilutions de MNase restantes aux aliquotes cellulaires restantes. Arrêtez la digestion de Mnase en ajoutant 200 μL de tampon STOP fraîchement préparé (150 μL de 10 mM Tris, pH 7,4, 25 μL de SDS à 10 %, 25 μL de protéinase K à 20 mg/mL, 2 μL de 0,5 M EGTA) dans chaque tube dans le même ordre et avec le même intervalle de temps que la MNase a été ajoutée. Incuber à 65 °C pendant 2 h. Ajouter 500 μL d’alcool phénol-chloroforme-isoamylique (PCI) à chaque échantillon et bien mélanger par vortex. Centrifuger à 19 800 x g pendant 5 min à RT pour séparer les phases, et transférer la phase aqueuse dans de nouveaux tubes (environ 200 μL/échantillon).ATTENTION : Le PCI contient de nombreux composants toxiques et ne doit être manipulé que dans une cagoule de sécurité chimique. Veuillez consulter le fabricant pour plus de détails. Purifier l’ADN à l’aide d’une trousse de purification d’ADN commerciale (voir le tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant et éluer les échantillons dans 12 μL de tampon d’élution.REMARQUE : La concentration de SDS de l’étape de déprotéinisation (étape 2.5) est inhibitrice pour certains kits de purification de l’ADN. Le kit de purification de l’ADN utilisé ici fonctionne de manière comparable à la précipitation à l’éthanol. Ajouter 2 à 5 μL de colorant de chargement et faire passer les échantillons sur un gel d’agarose à 1,5 % à 120 V pendant 30 à 50 minutes (jusqu’à ce qu’ils soient correctement séparés ; Graphique 1A). Choisissez le meilleur degré de digestion pour l’expérience et poursuivez avec la digestion préparative de la MNase. Un degré de digestion optimal présente peu ou pas de fragments sous-nucléosomales et un rapport mono- / di-nucléosome de 70 % à 90 %.NOTA : Dans cette expérience, le degré de digestion de la voie 4 de la figure 1A a été déterminé comme étant la digestion optimale obtenue avec 0,625-1,25 U de Mnase pour 2,5 x 105 cellules (= 2,5-5 U de Mnase pour 1 x 106 cellules). Pour une discussion détaillée, voir les résultats représentatifs. 3. Digestion préparative de la MNase Pour fragmenter la chromatine en mononucléosomes par digestion MNase, décongeler des aliquotes de 5 x 106 cellules préalablement réticulées et les remettre en suspension dans 1 mL de DPBS. Incuber sur de la glace pendant 20 min (ajouter 1x BSA si les cellules collent à la paroi du tube). Prélever les cellules par centrifugation à 10 000 x g pendant 5 min à RT, et jeter le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 500 μL de tampon MB#1. Répétez l’étape de centrifugation une fois. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon MB#1 et faire 200 μL d’aliquotes (1 x 106 cellules par aliquote). Sur la base du titrage MNase (décrit à l’étape 2), digérer la chromatine en ajoutant la quantité appropriée de MNase (généralement 2,5 à 10 U/μL par 1 x 106 cellules) à chaque aliquote. Bien mélanger (tourbillonner et essorer rapidement) et incuber sur un thermomélangeur à 37 °C pendant 10 min en agitant à 800 tr/min. Arrêtez la digestion de la MNase en ajoutant 1,6 μL d’EGTA 0,5 M (4 mM final) à chaque aliquote, et incubez sur un thermomélangeur à 65 °C pendant 10 min avec 800 tr/min d’agitation. Prélever l’échantillon par centrifugation à 10 000 x g pendant 5 min à RT, et jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de 1x NEBuffer 2.1. Regroupez des échantillons équivalents à une entrée de 5 x 10,6 cellules ou moins pour un traitement ultérieur.REMARQUE : Si plus de 5 x 10 6 cellules doivent être traitées, traitez ces échantillons en parallèle, car les conditions enzymatiques sont optimisées pour 5 x 106 cellules. Avant de passer aux étapes de ligature de proximité, transférez 10 % de l’échantillon en tant que témoin d’entrée pour contrôler le niveau de digestion de la MNase. Ajouter 150 μL de Tris 10 mM à pH 7,4, 25 μL de SDS à 10 % et 25 μL de protéinase K à 20 mg/mL à cet échantillon, et incuber toute la nuit à 65 °C. 4. Traitement de l’extrémité de l’ADN et ligature de proximité Prélever l’échantillon restant par centrifugation à 10 000 x g pendant 5 min à 4 °C, et jeter le surnageant. Remettre le granulé en suspension dans 90 μL de mélange maître Micro-C fraîchement préparé 1 (tableau 1) et incuber sur un thermomélangeur pendant 15 min à 37 °C avec 800 tr/min d’agitation. Ajouter 10 μL de 5 U/μL de Klenow Fragment et incuber au thermomélangeur pendant 15 min à 37 °C en agitant à 800 tr/min. Ajouter 100 μL de mélange maître Micro-C fraîchement préparé 2 (tableau 2) et incuber sur un thermomélangeur pendant 45 min à 25 °C avec 800 tr/min d’agitation. Après incubation, éteindre la réaction enzymatique en ajoutant de l’EDTA à une concentration finale de 30 mM. Incuber sur un thermomélangeur pendant 20 min à 65 °C avec 800 tr/min d’agitation. Prélever l’échantillon par centrifugation à 10 000 x g pendant 5 min à 4 °C, et jeter le surnageant. Remettre l’échantillon en suspension dans 500 μL de mélange maître Micro-C fraîchement préparé 3 (tableau 3) et incuber pendant 2,5 h à RT avec rotation (15-20 tr/min). Prélever l’échantillon par centrifugation à 10 000 x g pendant 5 min à 4 °C, et jeter le surnageant. Remettre l’échantillon en suspension dans 200 μL de mélange maître Micro-C fraîchement préparé 4 (tableau 4) et incuber sur un thermomélangeur pendant 15 min à 37 °C avec 800 tr/min d’agitation. Pour la réticulation inverse et la déprotéination, ajouter 25 μL de protéinase K à 20 mg/mL et 25 μL de SDS à 10 % à l’échantillon, et incuber à 65 °C pendant la nuit avec un mélange intermittent. 5. Purification de l’ADN di-nucléosomique et sélection de la taille Ajoutez 500 μL de PCI aux échantillons et au contrôle d’entrée, et mélangez par vortex. Séparez les phases par centrifugation à 19 800 x g pendant 5 min, et transférez la phase aqueuse supérieure dans un tube frais. Concentrez l’ADN soit à l’aide d’un kit de purification d’ADN, soit par précipitation à l’éthanol. Éluer les échantillons dans 30 μL (étape 5.3) et les témoins d’entrée (étape 3.11) dans 15 μL, et appliquer un gel d’agarose à 1,5 % pour séparer les mononucléosomes et les dinucléosomes (Figure 1B).REMARQUE : La concentration de SDS de l’étape de déprotéinisation est inhibitrice pour certains kits de purification de l’ADN. Le kit de purification de l’ADN utilisé ici (voir le tableau des matériaux) fonctionne de manière comparable à la précipitation à l’éthanol. Selon le nombre de cellules utilisées, l’entrée peut aller de 100 ng à 10 μg. En règle générale, 1 à 5 μg d’ADN sont extraits de 5 x 106 cellules. Exciser les fragments d’ADN qui ont une taille di-nucléosomique (environ 300 pb). Utilisez un kit d’élution de gel d’ADN disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) pour extraire l’ADN du gel d’agarose et éluer dans 150 μL. 6. Préparation des billes de streptavidine Transférer 10 μL de billes de streptavidine (voir le tableau des matériaux) par échantillon dans un tube de réaction. Placez-le dans un aimant approprié pour les tubes de 1,5 ml (voir le tableau des matériaux). Une fois la solution éliminée (1 à 2 min), retirer le surnageant et remettre les billes en suspension dans 300 μL de 1x TBW (5 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M de NaCl, 0,05 % Tween 20) par échantillon. Répétez cette étape une fois. Remettre les billes en suspension dans 150 μL de tampon N&B 2x (10 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM d’EDTA, 2 M de NaCl) par échantillon traité à l’étape 7. 7. Préparation de la bibliothèque de streptavidines et sur perles Ajouter 150 μL de billes prépréparées (étape 6.3) à 150 μL de l’échantillon (étape 5.3). Incuber pendant 20 min à RT avec rotation (15-20 tr/min). Placez les tubes dans un aimant approprié et attendez que la solution disparaisse (1-2 min). Retirer le surnageant et remettre les billes en suspension dans 300 μL de 1x TBW. Répétez cette étape. Placez les tubes dans un aimant approprié et attendez que la solution disparaisse (1-2 min). Retirer le surnageant et remettre les billes en suspension dans 100 μL de 0,1x TE (1 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Placez les tubes dans un aimant approprié et attendez que la solution disparaisse (1-2 min). Retirer le surnageant, remettre les billes en suspension dans 50 μL de 0,1x TE et les transférer dans des tubes PCR.NOTA : Le volume de 0,1x TE utilisé (50 μL) correspond au volume d’entrée de la trousse de préparation de la bibliothèque de séquençage de l’ADN (voir le tableau des matériaux) utilisée dans ce protocole. Si vous utilisez un kit ou une stratégie différente, ajustez le volume en conséquence. Effectuer les étapes de manipulation de l’ADN du kit de préparation de la bibliothèque de séquençage selon le protocole du fabricant. Ces étapes comprennent généralement l’émoussement de l’ADN, l’a-tailing, la ligature de l’adaptateur et l’excision de l’U. La dernière étape (excision de l’uranium) est spécifique au kit utilisé dans cette étude. Si vous utilisez ce kit, suivez les instructions du fabricant de l’étape 1 à l’étape 2.6 du protocole du kit en utilisant des adaptateurs non dilués, et ne tenez pas compte du stockage à −20 °C après l’étape 2.6.REMARQUE : Les changements de tampon requis par les kits de séquençage doivent être échangés par la liaison des billes à un aimant et par des lavages (étapes 7.3 à 7.4), car l’ADN est toujours lié aux billes de streptavidine. De plus, étant donné que l’ADN est lié aux billes magnétiques, ignorez toutes les étapes de purification et de sélection de la taille après la ligature de l’adaptateur du protocole du kit. Passez à l’étape 7.6 (ce protocole). Une fois la ligature de l’adaptateur terminée, lavez l’échantillon comme décrit à l’étape 7.2. Jeter le surnageant et remettre les billes en suspension dans 20 μL de 0,1x TE. 8. Estimation des cycles de PCR requis REMARQUE : Il est conseillé d’estimer les cycles de PCR requis pour l’amplification de la bibliothèque. En règle générale, une bibliothèque Micro-C nécessite 8 à 15 cycles de PCR. Bien que l’étape ne soit pas essentielle, elle permet d’éviter la suramplification et de réduire le risque de doublons PCR. Pour définir le nombre minimum de cycles de PCR requis, effectuez une PCR avec 1 μL d’échantillon d’ADN streptavidine-biotine (étape 7.6). Pour ce faire, ajoutez un mélange maître PCR (3,2 μL d’AmorceH2O, 0,4 μL d’amorce i5, 0,4 μL d’amorce i7 et 5 μL d’ADN polymérase haute fidélité Q5) à l’échantillon. Effectuez la PCR avec 16 cycles selon les instructions du fabricant pour le kit de préparation de la banque d’ADN utilisé.REMARQUE : Les apprêts utilisés ici sont achetés dans une trousse distincte (voir le tableau des matériaux) qui doit être compatible avec la trousse de préparation de bibliothèque utilisée. Après la PCR, prélever les billes à l’aide d’un aimant approprié et mesurer la concentration d’ADN de 1 μL du surnageant à l’aide d’un instrument de quantification de l’ADN à haute sensibilité (voir le tableau des matériaux). Pour obtenir la concentration totale d’ADN, multipliez cette valeur par 10 (volume total de la réaction PCR). Estimez le nombre requis de cycles de PCR tel qu’indiqué dans les résultats représentatifs. Ajouter 2 μL de tampon de charge 6x aux 9 μL restants de mélange PCR. Résoudre la bibliothèque amplifiée par PCR sur un gel d’agarose à 1 % pour déterminer la ligature réussie de l’adaptateur, ce qui donne une taille d’environ 450 pb (Figure 1C).REMARQUE : Le gel doit présenter une bande distincte d’environ 420 pb (bibliothèque Micro-C plus adaptateurs). Les bandes de 120 bp représentent les dimères de l’adaptateur et indiquent des bibliothèques de faible complexité. Des bandes de poids moléculaire inférieur peuvent apparaître (moins de 100 pb), et ce sont des amorces non utilisées de la réaction PCR. 9. Amplification de la bibliothèque de séquençage Ajouter le mélange maître PCR (65 μLd’H2O, 100 μL d’ADN polymérase haute fidélité Q5, 8 μL d’amorce i5, 8 μL d’amorce i7) aux 19 μL restants de l’échantillon d’ADN streptavidine-biotine. Diviser le mélange réactionnel en aliquotes de 50 à 100 μL.REMARQUE : Le volume optimal pour la PCR dépend de la machine PCR ; En règle générale, 50 μL offre l’amplification la plus reproductible dans les machines PCR courantes. Effectuez la PCR selon les instructions du fabricant du kit de préparation de la banque d’ADN avec le nombre de cycles déterminé à l’étape 8. Si l’étape 8 a été omise, 14 cycles sont recommandés pour la PCR. Purifier l’ADN avec des billes paramagnétiques (voir tableau des matériaux) dans un rapport de 1 :0,9 selon le protocole du fabricant. Élue dans 20 μL de 0,1 % TE.REMARQUE : Si des dimères d’adaptateur sont détectés à l’étape 8.5, effectuez la purification deux fois en utilisant le même rapport. Déterminer la concentration d’ADN et soumettre les échantillons à un système de contrôle de la qualité (voir le tableau des matériaux). Assurer la bonne qualité de la bibliothèque Micro-C par la présence d’une seule bande précise (Figure 1D).REMARQUE : Les dimères adaptateurs sont rares dans les préparations de banques sur billes en raison des lavages d’échantillons avant la PCR. Ainsi, l’apparition de dimères d’adaptateur indique une faible complexité de la bibliothèque. Si des dimères adaptateurs sont observés, il est fortement recommandé de contrôler la qualité de l’échantillon avec un séquençage d’entrée faible. 10. Séquençage de l’ADN et traitement des données Séquençez la bibliothèque Micro-C avec le séquençage des extrémités appariées en fonction des exigences du fournisseur de séquençage.REMARQUE : Idéalement, les échantillons sont séquencés sur une plate-forme en mode apparié avec 50 pb par lecture. Les plates-formes plus anciennes qui offrent des durées de lecture plus courtes, telles que 2 x 35 bp, ont également été utilisées avec succès. Il est important de noter que si des régions génomiques répétitives sont étudiées, il peut être conseillé de séquencer avec une longueur de lecture plus longue. Pour évaluer la qualité de la bibliothèque Micro-C, effectuez un séquençage d’entrée faible avec 5 x 106 à 1 x 107 lectures par échantillon. Traitez les fichiers de séquençage (fichiers fastq) avec Distiller10. Comparez les lectures au génome de référence approprié, ici mm10.REMARQUE : Les fichiers de séquençage peuvent être traités à l’aide de divers pipelines sur des ordinateurs locaux ou des clusters informatiques. Pour les échantillons avec de faibles profondeurs de séquençage, des tailles de groupe plus importantes, telles que 10 000 bp, 50 000 bp, 100 000 bp et 500 000 bp, peuvent réduire les demandes de calcul et la taille des fichiers. Distiller (utilisé dans cette étude) génère tous les types de fichiers nécessaires pour évaluer la qualité de la bibliothèque Micro-C. Le fichier *.stats généré contient les informations sur le taux de mappage, les rapports cis-trans et l’orientation de lecture stratifiés par la distance entre les paires lues. Ces paramètres sont visualisés dans la figure 2, et l’évaluation de la qualité de la bibliothèque Micro-C est discutée dans les résultats représentatifs. Le logiciel de traitement génère également des fichiers mcool qui peuvent être directement chargés dans HiGlass (https://docs.higlass.io/) pour générer des matrices d’interaction9.
Representative Results
La préparation réussie des bibliothèques Micro-C peut être évaluée en plusieurs étapes du protocole. L’étape la plus importante est le choix d’un bon degré de digestion MNase. Par conséquent, la concentration de MNase doit être titrée pour obtenir de manière constante 70 à 90 % de mononucléosomes par rapport aux dinucléosomes pour chaque échantillon. Il est important de noter que la digestion de la chromatine est différente pour l’eu- et l’hétérochromatine, la MNase digérant l’hétérochromatine moins efficacement. Ainsi, le degré de digestion optimal dépend de la région de chromatine d’intérêt et du type de cellule étudié, car la proportion relative d’eu- et d’hétérochromatine est spécifique au type de cellule. Par conséquent, il est conseillé de titrer soigneusement la concentration de MNase requise et d’évaluer d’abord le succès de l’expérience Micro-C par séquençage à faible niveau d’entrée. La figure 1A montre un schéma de titrage typique de la chromatine traitée avec des quantités décroissantes de MNase. Ici, la chromatine de 250 000 cellules par réaction est digérée avec une dilution quadruple de MNase. La concentration la plus élevée (10 U de MNase, voie 2) montre une chromatine surdigérée presque exclusivement constituée d’ADN mononucléosomique (~150 pb). Notamment, le centre de la bande mononucléosomale est plus bas dans le gel d’agarose par rapport aux bandes correspondantes dans les échantillons avec des concentrations réduites de MNase, indiquant une surdigestion de l’ADN nucléosomal. Les nucléosomes trop digérés sont ligaturés de manière inefficace dans la réaction de ligature de proximité ; par conséquent, l’échantillon de la voie 2 n’est pas optimal pour les expériences Micro-C. La voie 3 (2,5 U de MNase) affiche un degré de digestion presque approprié pour les expériences Micro-C. Ici, la bande mononucléosomale est l’espèce dominante, et le frottis sous-nucléosomal, indiquant des nucléosomes trop digérés, est réduit ; cependant, il est toujours présent. Le degré de digestion dans la voie 4 (0,635 U de MNase) est une condition idéale pour une expérience Micro-C dans cet exemple de titrage. Une bande mononucléosomale transparente sans ADN sous-nucléosomique est présente. L’intensité de la bande pour l’ADN mononucléosome et dinucléosome est presque égale, ce qui indique un rendement mononucléosome de 66% ou plus. Il convient de noter que l’ADN di-nucléosomique est environ deux fois plus grand que l’ADN mono-nucléosomique (~320 pb contre ~150 pb), de sorte que son intensité de bande par mole d’ADN est deux fois plus élevée que son homologue mono-nucléosomal. Le degré de digestion dans la voie 5 (0,156 U de MNase) montre une chromatine sous-digérée avec presque pas d’ADN nucléosomique, ce qui représente donc un échantillon sous-optimal. En conclusion, dans cet exemple, la digestion de 2,5 x 105 cellules ES de souris avec 0,625 U de MNase (correspondant à 2,5 U de MNase pour 1 x 106 cellules dans 200 μL) offre le point de départ le plus prometteur pour les digestions préparatives dans les expériences Micro-C. Cependant, une concentration intermédiaire de MNase entre les conditions utilisées pour les échantillons de la voie 3 et de la voie 4 (correspondant à 5 U de MNase pour 1 x 106 cellules dans 200 μL) doit également être envisagée. Il est important de noter que la digestion de la chromatine avec la MNase ne peut pas être mise à l’échelle linéairement et qu’il n’est pas recommandé d’augmenter la digestion préparative de plus de 4 fois. Pour préparer des banques Micro-C à partir de plus de 1 x 10 6 cellules, il est conseillé de digérer la chromatine en aliquotes de 1 x 106 cellules et de les regrouper après inactivation de la MNase. Pour évaluer le succès du protocole de ligature de proximité, le témoin d’entrée, qui est digéré par la MNase et non ligaturé par proximité (étape 3.8), doit être comparé à l’échantillon ligaturé par proximité (étape 5.3) par électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5 % (Figure 1B). La bande des mononucléosomes ligaturés par proximité a une taille approximative de 300 pb, similaire à celle des dinucléosomes. Par conséquent, le rapport du signal de bande mono- à dinucléosomique devrait passer de la prédominance des mono-nucléosomes (voie 1) aux di-nucléosomes (voie 3 et voie 4). Comme le gel d’agarose dans cette étape est l’ADN di-nucléosomique qui est excisé et purifié, il est conseillé de diviser les échantillons en plusieurs voies pour éviter la surcharge. Il est recommandé d’évaluer la qualité et la quantité de la bibliothèque de séquençage préparée par PCR minimale. Ici, l’ADN de 1 μL de billes (1/20 de l’échantillon total) est amplifié pendant 16 cycles dans 10 μL de réaction PCR. La concentration totale de la banque de PCR minimale varie généralement de 50 à 500 ng après 16 cycles de PCR. En théorie, cela correspond à une bibliothèque de 1 à 10 μg à partir de l’échantillon de 19 μL restant si elle était également amplifiée pendant 16 cycles. Il est recommandé d’utiliser le nombre minimum de cycles de PCR nécessaires pour générer une bibliothèque d’environ 100 ng à partir de l’ADN total. En supposant une amplification logarithmique dans la PCR, la concentration théorique de l’ADN obtenue à partir de l’entrée de 19 μL à 16 cycles peut être divisée successivement par deux pour calculer le nombre de cycles de PCR nécessaires pour générer une bibliothèque de 100 ng. Par exemple, un rendement de 100 ng à partir de 1 μL après 16 cycles correspond à un rendement de 1 900 ng amplifié à partir de 19 μL. Dans ce scénario, 12 cycles devraient idéalement générer une bibliothèque de séquençage de 118 ng à partir de l’ADN total (1 900 ng/[2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng). L’échantillon restant de 9 μL provenant de la PCR minimale peut ensuite être utilisé pour évaluer la qualité de la bibliothèque par électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 1C). La visualisation doit montrer une bande distincte à 420 pb et aucune bande pour les dimères de l’adaptateur (120 pb). Des fragments plus petits peuvent également apparaître, et ceux-ci correspondent à des amorces PCR inutilisées. Ensuite, il est recommandé d’analyser et de confirmer la réussite de la préparation d’échantillons Micro-C par séquençage à faible niveau d’entrée avant de s’engager dans un séquençage profond gourmand en ressources. En règle générale, les bibliothèques sont séquencées à une profondeur de lecture de 5 x 106 à 1 x 107 et évaluées en fonction des critères suivants : le taux de duplication de lecture de séquençage, le taux d’interaction cis- versus trans-chromosomique et la fréquence d’orientation de lecture de séquençage. Les bibliothèques Micro-C sont traitées avec Distiller, un pipeline à service complet qui traite les données du séquençage des fichiers de lecture (format Fastq) vers les fichiers de paires de lecture (format Bedpe) et les matrices d’interaction évolutives (formats Cool et Mcool) à l’aide de cooler, pairtools et cooltools10,11,12. Le pipeline génère également un fichier récapitulatif qui est idéal pour évaluer la qualité des bibliothèques Micro-C10 (https://github.com/open2c/distiller-nf). Le taux de duplication PCR fournit des informations sur la complexité de la bibliothèque de séquençage et peut être extrait du fichier *.stats généré. Les bibliothèques Micro-C de haute qualité ont des taux de duplication de PCR inférieurs à 5 à 10 % lorsqu’elles sont générées à partir de 5 millions de cellules ou plus. Notamment, certaines plates-formes de séquençage génèrent des doublons de PCR lors de la formation des clusters, indépendamment de la complexité de la bibliothèque de séquençage. La figure 2A montre les taux de duplication relatifs de deux expériences : l’une que nous considérons comme un bon échantillon et l’autre comme un mauvais échantillon. Dans cet exemple, les deux échantillons affichaient des taux de carte acceptables. Le critère suivant pour évaluer la qualité des bibliothèques Micro-C est le rapport cis versus trans et les fréquences d’orientation en lecture. À l’intérieur du noyau, les chromosomes habitent des territoires chromosomiques individuels et, par conséquent, interagissent rarement avec d’autres chromosomes. Un taux élevé d’interactions transchromosomiques détectées indique un taux élevé de ligatures aléatoires. Il est à noter qu’à ce niveau d’analyse, le mauvais échantillon présentait un taux élevé d’interactions transchromosomiques par rapport au bon échantillon (Figure 2B). Pour Micro-C, un taux d’interaction cis-chromosomique de 70 % ou plus est souhaitable. Une banque Micro-C a une taille de fragment similaire à la bande d’ADN di-nucléosomique, qui peut co-purifier avec l’échantillon ligaturé de proximité et contaminer l’expérience. Ces contaminants sont toujours des interactions cis-chromosomiques. Par conséquent, il est important d’évaluer également les taux d’orientation de lecture. Le taux de contamination dinucléosomale peut être estimé par séquençage à faible niveau d’entrée. L’ADN dinucléosomique provient de deux nucléosomes voisins qui n’ont pas été clivés par MNase. Ainsi, les lectures de séquençage résultantes afficheront toujours une orientation de lecture avant-arrière (F et R), et la distance entre les paires lues sera d’environ 320 pb. Les fragments ligaturés par proximité, en comparaison, peuvent être ligaturés dans quatre orientations, ce qui donne des paires de lecture avec F-R, R-R, R-F et F-F, idéalement avec une abondance égale (Figure 2C). De plus, ils affichent différentes distances entre les deux paires de lecture. Pour estimer la quantité de contaminants dinucléosomales, la fréquence des orientations de lecture peut être calculée à partir des fichiers *stats générés par le distillateur (Figure 2D). Notamment, dans ce travail, la fraction des lectures F-R (en rouge) était plus élevée dans le mauvais échantillon que dans le bon échantillon, et cela est devenu plus évident lorsque les orientations lues ont été stratifiées en fonction de la distance (Figure 2E). La fraction F-R est dominée par les fragments di-nucléosomales par rapport aux banques Micro-C lorsque les paires de lecture sont stratifiées en lectures avec des distances de <562 pb ou ≥562 pb. Ici, la fraction des lectures avec une distance de <562 pb est dominée par les lectures F-R, tandis que la fraction avec des distances ≥562 pb affiche une distribution uniforme entre les quatre orientations possibles, ce qui indique que la surreprésentation globale des lectures F-R provient de contaminants dinucléosomales. Le choix de 562 pb comme seuil pour le sous-ensemble est défini par le binning dans le fichier *stats généré. Bien que cela ne soit pas nécessaire pour ce contrôle de qualité, il est possible d’obtenir un sous-ensemble plus défini en extrayant les distances du fichier *pairs, qui est également généré par le distillateur. Il est important de noter que les lectures dinucléosomales ne diminuent pas la qualité de l’échantillon Micro-C car elles peuvent être identifiées et ignorées lors du traitement des données. Cependant, ils ne contiennent pas d’informations précieuses sur les interactions 3D et diluent les lectures informatives. Ainsi, un titrage minutieux de la MNase et un contrôle de qualité approfondi avec un séquençage à faible entrée sont les meilleurs outils pour optimiser la qualité des expériences Micro-C. Figure 1 : Etapes intermédiaires du protocole Micro-C. (A) Électrophorèse sur gel d’agarose de la chromatine à partir de 2,5 x 105 cellules ES de souris digérées avec des concentrations variables de MNase. Les bandes mono-, di- et tri-nucléosomales sont indiquées par des flèches. M : échelle d’ADN (couloir 1/6) ; 10 U de MNase pour 250 000 cellules (voie 2) ; 2,5 U de MNase par 250 000 cellules (voie 3) ; 0,625 U de MNase par 250 000 cellules (voie 4) ; 0,156 U de MNase pour 250 000 cellules (voie 2). (B) L’électrophorèse sur gel d’agarose à 1,0 % des échantillons préparés par Micro-C (voies 3 et 4) et le témoin d’entrée digéré par MNase (voie 1). Les voies 1 et 2 (M : échelle d’ADN) sont améliorées pour mettre l’accent sur le changement relatif de l’intensité des fragments mononucléosomales à dinucléosomiques. Les bandes mono- et di-nucléosomales sont indiquées par des flèches. La bande dinucléosomale de l’échantillon ligaturé à proximité combine l’ADN dinucléosomique et l’ADN de la bibliothèque Micro-C. (C) L’électrophorèse sur gel d’agarose à 1,0 % des banques de séquençage Micro-C amplifiée à partir d’un échantillon de 1 μL pour évaluer la qualité. Voie 1 (M) : échelle d’ADN ; Couloir 2 (S) : Bibliothèque Mirco-C. (D) Trace de l’analyseur de fragments de la bibliothèque Micro-C finale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Statistiques de l’échantillon pour le séquençage à faible entrée d’un bon échantillon et d’un mauvais échantillon. (A) Graphique à barres du pourcentage mappé (vert) et non mappé (rouge). (B) Fraction normalisée des lectures cartographiant les interactions cis et trans-chromosomiques. Les ensembles de données ont été normalisés en fonction de la lecture de la cartographie cis. Les lectures de cis-mapping ont été stratifiées en fonction de la distance entre la première et la deuxième lecture des échantillons séquencés par paires : ≤1 kbp (jaune), >1 kbp et ≤10 kbp (orange) et >10 kbp (rouge). (C) Schéma des espèces moléculaires potentielles avec les tailles di-nucléosomiales. (D) Pourcentages d’orientations des paires de lecture de toutes les lectures du bon échantillon et du mauvais échantillon. (E) Identique au panneau (D) mais stratifié par les distances (gauche, <562 pb et droite, ≥562 pb). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Composants 1 fois 4,4 fois 10x NEBuffer 2.1, 10 μL 44 μL 2 μL 100 mM ATP 2 μL 8,8 μL 100 mM TNT 5 μL 22 μL H2O 68 μL 299,2 μL 10 U/μL T4 PNK 5 μL 22 μL Total 90 μL 396 μL Tableau 1 : Mélange maître Micro-C 1. Composition du master mix pour la réaction de mastication finale. Composants 1 fois 4,4 fois 1 mM de biotine-dATP 10 μL 44 μL 1 mM de biotine-dCTP 10 μL 44 μL Mélange de 10 mM de dTTP et de dGTP 1 μL 4,4 μL 10x tampon ADN ligase T4 5 μL 22 μL 200x BSA 0,25 μL 1,1 μL H2O 23,75 μL 104,5 μL Tableau 2 : Mixage maître Micro-C 2. Composition du mélange maître pour la réaction d’étiquetage final. Composants 1 fois 4,4 fois 10x tampon de réaction NEB T4 Ligase 50 μL 220 μL H2O 422,5 μL 1859 μL ADN ligase T4 25 μL 110μL Tableau 3 : Mélange maître Micro-C 3. Composition du mélange maître pour la réaction de ligature de proximité. Composants 1 fois 4,4 fois 10x NEBuffer 1.1 20 μL 88 μL H2O 180 μL 792 μL Nucléase ExoIII 10 μL 44 μL Tableau 4 : Mélange maître Micro-C 4. Composition du mélange maître pour la réaction d’élimination de la biotine.
Discussion
Le succès d’une expérience Micro-C dépend de quelques étapes critiques du protocole qui doivent être exécutées avec soin. Tout d’abord, la réticulation avec le réticulant supplémentaire DSG ou EGS peut conduire à l’agrégation de cellules, selon le type de cellule. L’ajout de 0,1 % à 0,5 % de BSA à la réaction de réticulation réduit considérablement l’agrégation sans affecter l’efficacité de la réticulation. Une réticulation inefficace peut entraîner une augmentation des taux d’interactions transchromosomiques qui indiquent des ligaturations aléatoires. La deuxième étape, mais la plus cruciale, de ce protocole est la digestion de la chromatine avec MNase. Une digestion sous-optimale de la chromatine entraîne une ligature de proximité inefficace (sur-digestion) ou une augmentation des taux de dinucléosomes non ligaturés de proximité (sous-digestion). L’efficacité de la réaction de ligature peut être évaluée par électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 1B) et est en outre mieux estimée par séquençage à faible entrée. Si le séquençage à faible niveau d’entrée révèle soit un taux de duplication élevé (ligature inefficace), soit une augmentation des taux de dinucléosomes, le degré de digestion de la MNase doit être réévalué. Notamment, la perte d’échantillon lors de l’exécution du protocole peut entraîner une réduction de la complexité de la bibliothèque. La concentration d’un échantillon est mieux évaluée après la purification de l’ADN (étape 5.3) ou par PCR minimale (étape 8). Le rendement total d’ADN de 5 x 106 cellules de mammifères après purification de l’ADN est généralement de >2 μg. La concentration d’ADN doit être contrôlée après la digestion de la MNase, la digestion de l’ExoIII et la purification de l’ADN. Les nucléases endogènes, dont l’abondance est spécifique au type cellulaire et à l’espèce, peuvent être une source de dégradation de l’ADN. De plus, la purification de l’ADN sur colonne peut entraîner une perte d’échantillon en raison de l’incompatibilité avec la SDS des réactions de déprotéination. La précipitation à l’éthanol peut être envisagée si la concentration d’ADN est faible à cette étape.
Étant donné que Micro-C nécessite un titrage MNase spécifique à l’échantillon, il est difficile d’appliquer Micro-C à des populations de petites cellules, telles que de petits organes provenant de divers organismes modèles, d’embryons et de cellules uniques, d’organoïdes ou de biopsies de patients. Ici, Hi-C 3.0 offre une alternative bien établie utilisant une réaction de point final par des endonucléases de restriction spécifiques à la séquence 8,9.
Micro-C est une technologie de conformation chromosomique à haute résolution largement applicable avec une plage dynamique élevée et un faible rapport signal/bruit, ce qui la rend particulièrement adaptée à l’étude des caractéristiques chromosomiques à courte portée 4,5,8, telles que les boucles chromosomiques. La résolution de Micro-C permet de capturer des boucles promoteur-amplificateur, qui sont au-delà de la limite de détection de Hi-C, permettant une analyse plus détaillée de la relation entre l’organisation du génome et la régulation13,14,15. De plus, des stratégies de capture de l’ADN ont récemment été combinées avec Micro-C pour augmenter la résolution spécifique au locus des loci génomiques ciblés à des niveaux sans précédent, révélant de nouvelles informations sur l’ultrastructure du génome 3D16,17,18. En résumé, nous envisageons que Micro-C et ses dérivés seront une technologie clé pour disséquer le rôle du génome 3D dans la régulation transcriptionnelle et, par conséquent, la différenciation et le maintien des types cellulaires.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Christl Gaubitz et Kathleen Stewart-Morgan pour leur lecture critique du manuscrit. Nous remercions Anja Groth et le laboratoire Groth pour leur soutien dans la création de notre laboratoire. Nous remercions le personnel de la plateforme de génomique CPR/reNEW pour son soutien : H. Wollmann, M. Michaut et A. Kalvisa. Le Centre de médecine des cellules souches de la Fondation Novo Nordisk (reNEW) est soutenu par la subvention numéro NNF21CC0073729 de la Fondation Novo Nordisk. Le Centre de recherche sur les protéines (CPR) de la Fondation Novo Nordisk est soutenu par la subvention numéro NNF14CC0001 de la Fondation Novo Nordisk. Nous remercions le laboratoire Brickman du Novo Nordisk Center for Stem Cell Medicine, reNEW Copenhagen, pour les cellules ES de souris.
Materials
| 1 mM Biotin dATP | Jenna Bioscience | NU-835-Bio14-S | |
| 1 mM Biotin dCTP | Jenna Bioscience | NU-809-BioX-S | |
| 10 mM dGTP | NEB | N0442S | |
| 10 mM dTTP | NEB | N0443S | |
| 10 U/ml T4 PNK | NEB | M0201L | |
| 100 U/L Exonuclease III | NEB | M0206L | |
| 10x NEBuffer 1.1 | NEB | B7001S | |
| 10x NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | |
| 10x T4 DNA Ligase buffer | NEB | B0202A | |
| 1x DPBS w/o Mg2+ and Ca2+ | ThermoFisher | 14190144 | |
| 1x LIF | |||
| 2_Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | 0.1 mM b-mercaptoethanol |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-500ML | Caution. See manufactures MSDS |
| 400 U/ml T4 DNA Ligase | NEB | M0202L | |
| 5 U/ml Klenow Fragment | NEB | M0210L | |
| Agarose | BIO-RAD | 1613102 | Caution. See manufactures MSDS |
| BSA 20mg/ml | NEB | B9000S | |
| CaCl2 | |||
| cell counter | |||
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D8418-100ML | Caution. See manufactures MSDS |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | refered to as: magnet magnet for 1.5 ml tubes |
| DynaMag-PCR Magnet | Invitrogen | 492025 | refered to as: magnet magnet for PCR tubes |
| EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | BioWorld | 40121266-1 | |
| Ethanol 96% | VWR Chemicals | 20824365 | quality control system |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | |
| Ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS) | ThermoFisher | 21565 | |
| Fetl Bovin Serum | Sigma Aldrich | F7524 | 15% FBS |
| Gel Loading dye purple (6X) | NEB | B7024S | |
| Glycine | PanReac AppliChem | A1067.0500 | |
| Halt Proteinase inhibitor (100x) | ThermoFisher | 78430 | Caution. See manufactures MSDS |
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | 18896-50ML | |
| MgCl 1 M | Invitrogen | AM9530G | |
| Micrococcal Nuclease (MNase) | Worthington | LS004798 | |
| mouse embryonic stem cells | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index primers) | NEB | E7600S | amplification primers for sequencing libraries |
| NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | NEB | E7645L | sequencing library preparation kit |
| NEBNext Ultra II Q5 Master mix | NEB | M0544S | Caution. See manufactures MSDS |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | 1x NEAA |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | 1% Pen-Strep |
| Proteinase K (40 mg/ml) | GoldBio | P-480-1 | Caution. See manufactures MSDS |
| QIAquick Gel extraction kit | QIAgen | 28706 | refered to as: DNA gel elution kit |
| QIAquick PCR purification kit | QIAgen | 28106 | refered to as: commercial DNA purification kit |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA quantification instrument |
| Quick load purple 1kb plus DNA Ladder | NEB | N0550S | |
| SPRIselect size selection beads | Beckman Coulter | B23319 | paramagnetic beads |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | refered to as: thermomixer |
| Tris | Merck | 10708976001 | |
| Trypsin | |||
| Tween20 | Sigma Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrapure 10% SDS | Invitrogen | 15553-035 | |
| Ultrapure Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol (PCI) | Invitrogen | 15593-031 | |
| Fragment Analyzer |
Referências
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Citar este artigo
Metelova, M., Jensen, R. R., Krietenstein, N. Mapping Mammalian 3D Genome Interactions with Micro-C-XL. J. Vis. Exp. (201), e64579, doi:10.3791/64579 (2023).