يتم تقديم بروتوكول لرسم خرائط تنظيم الجينوم ثلاثي الأبعاد بدقة النيوكليوسوم باستخدام طريقة التقاط التشكل على مستوى الجينوم Micro-C-XL هنا.
يعد تنظيم الكروموسوم ثلاثي الأبعاد (3D) عاملا رئيسيا في تنظيم الجينوم ومواصفات نوع الخلية. على سبيل المثال ، يعتقد أن العناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة ، والمعروفة باسم المعززات ، تنظم نشاط المروجين البعيدين من خلال التفاعل في الفضاء ثلاثي الأبعاد. لقد حولت تقنيات التقاط التشكل الكروموسومي على مستوى الجينوم (3C) ، مثل Hi-C ، فهمنا لكيفية تنظيم الجينوم في الخلايا. الفهم الحالي لتنظيم الجينوم ثلاثي الأبعاد محدود بالدقة التي يمكن من خلالها حل التنظيم الطوبولوجي للكروموسومات في الفضاء ثلاثي الأبعاد. يقيس Micro-C-XL طي الكروموسوم بدقة على مستوى النيوكليوسوم ، الوحدة الأساسية للكروماتين ، من خلال استخدام نوكلياز المكورات الدقيقة (MNase) لتجزئة الجينوم أثناء بروتوكول التقاط تشكل الكروموسوم. وهذا يؤدي إلى تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء في القياسات ، وبالتالي تسهيل الكشف بشكل أفضل عن مواقع العزل وحلقات الكروموسوم مقارنة بتقنيات 3D الأخرى على مستوى الجينوم. يتم تقديم بروتوكول مفصل ومفصل ومدعوم بصريا لإعداد عينات Micro-C-XL عالية الجودة من خلايا الثدييات في هذه المقالة.
Micro-C-XL هي تقنية على مستوى الجينوم لقياس تشكل الجينوم 3D بدقة نيوكليوسوم. يعتمد Micro-C-XL على تقنية Hi-C القائمة على ربط القرب المستخدمة على نطاق واسع ، والتي حولت فهمنا لكيفية تنظيم جينومات 3D1. تم تطوير Micro-C-XL وتكراره الأول ، Micro-C ، في البداية في Saccharomyces cerevisiae 2,3 وتم تكييفه لاحقا مع أنظمة خلايا الثدييات ، والتي أظهر البروتوكول إمكاناته الكاملة في الكشف عن الميزات قصيرة المدى للجينوم ثلاثي الأبعاد ، مثل حلقات الكروموسوم ومواقع العزل. يعتمد هذا الإصدار على منشورات Micro-C-XL الحديثة للثدييات 4,5. نظرا لأن Micro-C-XL يحل محل Micro-C ، يشار إلى Micro-C-XL من الآن فصاعدا باسم Micro-C في المخطوطة.
الاختلافات الرئيسية بين Micro-C و Hi-C6 هي كما يلي: 1) تجزئة الجينوم مع نوكلياز المكورات الدقيقة (MNase) مقارنة بإنزيمات التقييد و 2) روابط متشابكة إضافية مع تباعد ذري أكبر بين المجموعات التفاعلية مقارنة بالفورمالديهايد فقط. تساهم كلتا الخطوتين بشكل كبير في تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء في Micro-C مقارنة ب Hi-C التقليدي. يحد حجم التجزئة من الدقة التي يمكن من خلالها حل تنظيم الجينوم 3D أثناء بروتوكول ربط القرب. MNase هو نيوكلياز يهضم بشكل تفضيلي الحمض النووي الذي يمكن الوصول إليه ويترك الحمض النووي المحمي بالنيوكوسومات سليما. أظهرت بصمة النيوكليوسوم باستخدام تسلسل MNase أن النيوكليوسومات تغطي بالكامل معظم جينومات حقيقية النواة7. نظرا لأن النيوكليوسومات موزعة في جميع أنحاء الجينوم بمتوسط تباعد يتراوح بين 160 و 220 نقطة أساس ، اعتمادا على الأنواع ونوع الخلية ، فإن MNase هو الإنزيم المثالي لرسم خرائط عالية الدقة لبنية الجينوم.
بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي استخدام رابط متشابك إضافي مع الفورمالديهايد (FA) في طريقة Micro-C إلى تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء 2,8. تسهل الروابط المتشابكة الخاصة بالأمين مع الفواصل الذرية الأطول بين المجموعات التفاعلية الروابط المتقاطعة بين البروتين والبروتين. هذه عادة ما تكون غلوتارات ديسوتشينيميديل (DSG) أو إيثيلين جلايكول بيس-سكسينيميديل سكسينات (EGS) مع فواصل 7.7 Å و 16.1 Å ، على التوالي. يتضح تقليل الضوضاء من خلال EGS أو DSG بشكل خاص في التجارب ذات معدلات التجزئة العالية ، مثل Micro-C ، ويفترض أن يحدث بسبب انخفاض معدل أحداث الربط العشوائي8.
بروتوكول Hi-C 3.0 الذي تم تطويره مؤخرا والذي يستخدم التشابك ESG / DSG ومجموعات متعددة من إنزيمات التقييد يقلل من الضوضاء في تجارب Hi-C ويحسن بشكل كبير من اكتشاف حلقات الكروموسوم ومواقع العزل 8,9. ومع ذلك ، وجدت مقارنة كل موقع على حدة لميزات بيانات التفاعل المختلفة أن Micro-C كان لديه اكتشاف متفوق للميزات قصيرة المدى ، مثل حلقات الكروموسوم ومواقع العزل ، مقارنة بكل من Hi-C 3.0 و Hi-C8 التقليدي. ومع ذلك ، فإن Hi-C 3.0 يحسن اكتشاف الميزات قصيرة المدى ويحافظ على اكتشاف قوي لتجزئة الجينوم مقارنة ب Hi-C التقليدي. باختصار ، يجب تحديد اختيار طريقة التقاط تشكل الكروموسوم من خلال السؤال الموضوعي والبيولوجي.
هنا ، نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لتجارب Micro-C الناجحة التي يمكن أن تكشف عن تنظيم جينوم 3D.
يعتمد نجاح تجربة Micro-C على بعض الخطوات الحاسمة في البروتوكول التي يجب تنفيذها بعناية. أولا ، يمكن أن يؤدي التشابك مع DSG أو EGS الإضافي إلى تجميع الخلايا ، اعتمادا على نوع الخلية. إن إضافة 0.1٪ -0.5٪ BSA إلى تفاعل التشابك يقلل بشكل كبير من التجميع دون التأثير على كفاءة التشابك. يمكن أن يؤدي التشابك غير الفعال إلى زيادة معدلات التفاعلات عبر الكروموسومات التي تدل على الروابط العشوائية. الخطوة الثانية ، ولكن الأكثر أهمية ، في هذا البروتوكول هي هضم الكروماتين مع MNase. يؤدي هضم الكروماتين دون المستوى الأمثل إلى عدم كفاءة ربط القرب (الإفراط في الهضم) أو زيادة معدلات ثنائي النيوكليوسومات غير القريب (نقص الهضم). يمكن تقييم كفاءة تفاعل الربط عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز (الشكل 1 ب) ويتم تقديره بشكل أفضل من خلال التسلسل منخفض المدخلات. إذا كشف تسلسل المدخلات المنخفضة إما عن معدل تكرار مرتفع (ربط غير فعال) أو زيادة معدلات ثنائي النوكليوسوم ، فيجب إعادة تقييم درجة هضم MNase. والجدير بالذكر أن فقدان العينة عند تنفيذ البروتوكول يمكن أن يؤدي إلى تقليل تعقيد المكتبة. من الأفضل تقييم تركيز العينة بعد تنقية الحمض النووي (الخطوة 5.3) أو عن طريق الحد الأدنى من تفاعل البوليميراز المتسلسل (الخطوة 8). العائد الإجمالي للحمض النووي من 5 × 106 خلايا الثدييات بعد تنقية الحمض النووي هو عادة >2 ميكروغرام. يجب التحكم في تركيز الحمض النووي بعد هضم MNase وهضم ExoIII وتنقية الحمض النووي. يمكن أن تكون النيوكليازات الداخلية ، التي تكون وفرتها خاصة بنوع الخلية والأنواع الخاصة بها ، مصدرا لتدهور الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي تنقية الحمض النووي المستندة إلى العمود إلى فقدان العينة بسبب عدم التوافق مع SDS من تفاعلات إزالة البروتين. يمكن اعتبار ترسيب الإيثانول إذا كان تركيز الحمض النووي منخفضا في هذه الخطوة.
نظرا لأن Micro-C يتطلب معايرة MNase الخاصة بالعينة ، فمن الصعب تطبيق Micro-C على مجموعات الخلايا الصغيرة ، مثل الأعضاء الصغيرة من الكائنات الحية النموذجية المختلفة أو الأجنة والخلايا المفردة أو المواد العضوية أو خزعات المريض. هنا ، يقدم Hi-C 3.0 بديلا راسخا باستخدام تفاعل نقطة النهاية عن طريق نوكلياز التقييد الخاص بالتسلسل 8,9.
Micro-C هي تقنية تشكيل كروموسوم عالية الدقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع مع نطاق ديناميكي عالي ونسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة ، مما يجعلها مناسبة بشكل خاص للتحقيق في ميزات الكروموسوم قصيرة المدى4،5،8 ، مثل حلقات الكروموسوم. تسمح دقة Micro-C بالتقاط حلقات محسن المروج ، والتي تتجاوز حد الكشف عن Hi-C ، مما يتيح بكفاءة تحليلا أكثر تفصيلا للعلاقة بين تنظيم الجينوم واللائحة13،14،15. علاوة على ذلك ، تم مؤخرا دمج استراتيجيات التقاط الحمض النووي مع Micro-C لزيادة الدقة الخاصة بالموقع للمواقع الجينومية المستهدفة إلى مستويات غير مسبوقة ، مما يكشف عن رؤى جديدة حول البنية التحتية للجينوم ثلاثي الأبعاد16،17،18. باختصار ، نتصور أن Micro-C ومشتقاته ستكون تقنية رئيسية لتشريح دور جينوم 3D في تنظيم النسخ ، وبالتالي تمايز نوع الخلية وصيانتها.
The authors have nothing to disclose.
نشكر كريستل غوبيتز وكاثلين ستيوارت مورغان على قراءتهما النقدية للمخطوطة. نشكر أنجا غروث ومختبر غروث على دعمهم في إنشاء مختبرنا. نشكر موظفي منصة CPR / reNEW Genomics على الدعم: H. Wollmann و M. Michaut و A. Kalvisa. يتم دعم مركز مؤسسة نوفو نورديسك لطب الخلايا الجذعية (reNEW) من قبل مؤسسة نوفو نورديسك رقم المنحة NNF21CC0073729. يتم دعم مركز مؤسسة نوفو نورديسك لأبحاث البروتين (CPR) من قبل مؤسسة نوفو نورديسك رقم المنحة NNF14CC0001. نشكر مختبر بريكمان في مركز نوفو نورديسك لطب الخلايا الجذعية ، reNEW كوبنهاغن ، على الخلايا الجذعية الجنينية للفأر.
1 mM Biotin dATP | Jenna Bioscience | NU-835-Bio14-S | |
1 mM Biotin dCTP | Jenna Bioscience | NU-809-BioX-S | |
10 mM dGTP | NEB | N0442S | |
10 mM dTTP | NEB | N0443S | |
10 U/ml T4 PNK | NEB | M0201L | |
100 U/L Exonuclease III | NEB | M0206L | |
10x NEBuffer 1.1 | NEB | B7001S | |
10x NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | |
10x T4 DNA Ligase buffer | NEB | B0202A | |
1x DPBS w/o Mg2+ and Ca2+ | ThermoFisher | 14190144 | |
1x LIF | |||
2_Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | 0.1 mM b-mercaptoethanol |
37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-500ML | Caution. See manufactures MSDS |
400 U/ml T4 DNA Ligase | NEB | M0202L | |
5 U/ml Klenow Fragment | NEB | M0210L | |
Agarose | BIO-RAD | 1613102 | Caution. See manufactures MSDS |
BSA 20mg/ml | NEB | B9000S | |
CaCl2 | |||
cell counter | |||
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D8418-100ML | Caution. See manufactures MSDS |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | refered to as: magnet magnet for 1.5 ml tubes |
DynaMag-PCR Magnet | Invitrogen | 492025 | refered to as: magnet magnet for PCR tubes |
EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | BioWorld | 40121266-1 | |
Ethanol 96% | VWR Chemicals | 20824365 | quality control system |
Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | |
Ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS) | ThermoFisher | 21565 | |
Fetl Bovin Serum | Sigma Aldrich | F7524 | 15% FBS |
Gel Loading dye purple (6X) | NEB | B7024S | |
Glycine | PanReac AppliChem | A1067.0500 | |
Halt Proteinase inhibitor (100x) | ThermoFisher | 78430 | Caution. See manufactures MSDS |
IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | 18896-50ML | |
MgCl 1 M | Invitrogen | AM9530G | |
Micrococcal Nuclease (MNase) | Worthington | LS004798 | |
mouse embryonic stem cells | |||
NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index primers) | NEB | E7600S | amplification primers for sequencing libraries |
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | NEB | E7645L | sequencing library preparation kit |
NEBNext Ultra II Q5 Master mix | NEB | M0544S | Caution. See manufactures MSDS |
Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | 1x NEAA |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | 1% Pen-Strep |
Proteinase K (40 mg/ml) | GoldBio | P-480-1 | Caution. See manufactures MSDS |
QIAquick Gel extraction kit | QIAgen | 28706 | refered to as: DNA gel elution kit |
QIAquick PCR purification kit | QIAgen | 28106 | refered to as: commercial DNA purification kit |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA quantification instrument |
Quick load purple 1kb plus DNA Ladder | NEB | N0550S | |
SPRIselect size selection beads | Beckman Coulter | B23319 | paramagnetic beads |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | refered to as: thermomixer |
Tris | Merck | 10708976001 | |
Trypsin | |||
Tween20 | Sigma Aldrich | P7949-100ML | |
Ultrapure 10% SDS | Invitrogen | 15553-035 | |
Ultrapure Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol (PCI) | Invitrogen | 15593-031 | |
Fragment Analyzer |