Här presenteras ett protokoll för kartläggning av den tredimensionella genomorganisationen med nukleosomupplösning med hjälp av den genomomfattande kromosomkonformationsmetoden Micro-C-XL.
Tredimensionell (3D) kromosomorganisation är en viktig faktor i genomreglering och celltypsspecifikation. Till exempel tros cis-reglerande element, kända som förstärkare, reglera aktiviteten hos distala promotorer via interaktion i 3D-rymden. Genomomfattande kromosomkonformationsfångst (3C)-teknologier, såsom Hi-C, har förändrat vår förståelse av hur genom är organiserade i celler. Den nuvarande förståelsen av 3D-genomets organisation begränsas av den upplösning med vilken den topologiska organisationen av kromosomer i 3D-rymden kan lösas. Micro-C-XL mäter kromosomveckning med upplösning på nukleosomnivå, den grundläggande enheten för kromatin, genom att använda mikrokocknukleas (MNase) för att fragmentera genom under kromosomkonformationsfångstprotokollet. Detta resulterar i ett förbättrat signal-brusförhållande i mätningarna, vilket underlättar bättre detektion av isoleringsställen och kromosomslingor jämfört med andra genomomfattande 3D-tekniker. Ett visuellt stödt, detaljerat, steg-för-steg-protokoll för beredning av högkvalitativa Micro-C-XL-prover från däggdjursceller presenteras i den här artikeln.
Micro-C-XL är en genomomfattande teknik för att mäta 3D-genomkonformation med nukleosomupplösning. Micro-C-XL bygger på den allmänt använda närhetsligeringsbaserade Hi-C-tekniken, som har förändrat vår förståelse av hur 3D-genomär organiserade. Micro-C-XL och dess första iteration, Micro-C, utvecklades ursprungligen i Saccharomyces cerevisiae2,3 och anpassades senare till däggdjurscellsystem, för vilka protokollet har visat sin fulla potential för att detektera kortdistansegenskaper i 3D-genomet, såsom kromosomslingor och isoleringsställen. Denna version är baserad på de senaste publikationerna om däggdjurens Micro-C-XL 4,5. Eftersom Micro-C-XL ersätter Micro-C, kallas Micro-C-XL hädanefter för Micro-C i manuskriptet.
De största skillnaderna mellan Micro-C och Hi-C6 är följande: 1) genomfragmentering med mikrokocknukleas (MNase) jämfört med restriktionsenzymer och 2) ytterligare tvärbindare med större atomavstånd mellan de reaktiva grupperna jämfört med endast formaldehyd. Båda stegen bidrar avsevärt till det förbättrade signal-brusförhållandet för Micro-C jämfört med konventionell Hi-C. Fragmenteringsstorleken begränsar upplösningen till vilken 3D-genomorganisationen kan lösas upp under proximity-ligeringsprotokollet. MNas är ett nukleas som företrädesvis smälter tillgängligt DNA och lämnar nukleosomskyddat DNA intakt. Nukleosomfotavtryck med hjälp av MNase-sekvensering har visat att nukleosomer helt täcker de flesta eukaryota genom7. Eftersom nukleosomer är fördelade över hela genomet med ett genomsnittligt avstånd på 160-220 bp, beroende på art och celltyp, är MNas det idealiska enzymet för högupplöst kartläggning av genomarkitekturen.
Användningen av en extra tvärbindare i kombination med formaldehyd (FA) i Micro-C-metoden förbättrar dessutom signal-brusförhållandet 2,8. Aminspecifika tvärbindare med längre atomdistanser mellan de reaktiva grupperna underlättar protein-protein-tvärbindningar. Dessa är vanligtvis disuccinimidylglutarat (DSG) eller etylenglykolbisuccinimidylsuccinat (EGS) med 7,7 Å respektive 16,1 Å distanser. Minskningen av brus genom EGS eller DSG är särskilt tydlig i experiment med höga fragmenteringshastigheter, såsom Micro-C, och sker förmodligen på grund av en minskning av frekvensen av slumpmässiga ligeringshändelser8.
Ett nyligen utvecklat Hi-C 3.0-protokoll som använder ESG/DSG-tvärbindning och flera kombinationer av restriktionsenzymer minskar bruset i Hi-C-experiment och förbättrar avsevärt detektionen av kromosomslingor och isoleringsställen 8,9. En jämförelse av olika interaktionsdata visade dock att Micro-C hade överlägsen detektion av kortdistansegenskaper, såsom kromosomslingor och isoleringsställen, jämfört med både Hi-C 3.0 och konventionell Hi-C8. Hi-C 3.0 förbättrar dock detektionen av kortdistansegenskaper och bibehåller en stark detektion av genomkompartmentalisering jämfört med konventionell Hi-C. Sammanfattningsvis bör valet av en metod för att fånga kromosomkonformationer bestämmas av den objektiva och biologiska frågan.
Här tillhandahåller vi ett steg-för-steg-protokoll för framgångsrika Micro-C-experiment som kan reda ut 3D-genomets organisation.
Framgången för ett Micro-C-experiment beror på några kritiska steg i protokollet som måste utföras noggrant. För det första kan tvärbindning med den extra tvärbindaren DSG eller EGS leda till aggregering av celler, beroende på celltyp. Att lägga till 0,1%-0,5% BSA till tvärbindningsreaktionen minskar aggregeringen avsevärt utan att påverka tvärbindningseffektiviteten. Ineffektiv tvärbindning kan resultera i ökade frekvenser av transkromosomala interaktioner som tyder på slumpmässiga ligationer. Det andra, men mest avgörande, steget i detta protokoll är nedbrytningen av kromatin med MNase. Suboptimal kromatinnedbrytning leder till ineffektiv proximitetsligering (översmältning) eller ökad förekomst av icke-närhetsligerade di-nukleosomer (undermatsmältning). Ligeringsreaktionens effektivitet kan utvärderas med agarosgelelektrofores (Figur 1B) och uppskattas dessutom bäst genom sekvensering med låg input. Om sekvenseringen med låg inmatning visar antingen en hög duplikationshastighet (ineffektiv ligering) eller ökade di-nukleosomhastigheter, bör MNase-nedbrytningsgraden omvärderas. I synnerhet kan förlusten av prov vid körning av protokollet leda till minskad bibliotekskomplexitet. Koncentrationen av ett prov utvärderas bäst efter DNA-rening (steg 5.3) eller med minimal PCR (steg 8). Det totala utbytet av DNA från 5 x 106 däggdjursceller efter DNA-rening är vanligtvis >2 μg. DNA-koncentrationen bör kontrolleras efter MNase-uppslutningen, ExoIII-uppslutningen och DNA-reningen. Endogena nukleaser, vars överflöd är celltypsspecifikt och artspecifikt, kan vara en källa till DNA-nedbrytning. Dessutom kan kolonnbaserad DNA-rening leda till provförlust på grund av inkompatibilitet med SDS från deproteineringsreaktioner. Etanolutfällning kan övervägas om DNA-koncentrationen är låg i detta steg.
Eftersom Micro-C kräver provspecifik MNase-titrering är det utmanande att tillämpa Micro-C på små cellpopulationer, såsom med små organ från olika modellorganismer, embryon och enskilda celler, organoider eller patientbiopsier. Här erbjuder Hi-C 3.0 ett väletablerat alternativ med hjälp av en slutpunktsreaktion med sekvensspecifika restriktionsendonukleaser 8,9.
Micro-C är en allmänt användbar högupplösande kromosomkonformationsteknik med ett högt dynamiskt omfång och ett lågt signal-brusförhållande, vilket gör den särskilt lämplig för att undersöka kromosomegenskaper 4,5,8 på kort avstånd, såsom kromosomslingor. Upplösningen av Micro-C gör det möjligt att fånga promotor-förstärkarslingor, som ligger utanför detektionsgränsen för Hi-C, vilket effektivt möjliggör en mer detaljerad analys av förhållandet mellan genomorganisation och reglering13,14,15. Dessutom har DNA-fångststrategier nyligen kombinerats med Micro-C för att öka den locus-specifika upplösningen av de riktade genomiska loci till oöverträffade nivåer, vilket avslöjar nya insikter om ultrastrukturen hos 3D-genomet16,17,18. Sammanfattningsvis föreställer vi oss att Micro-C och dess derivat kommer att vara en nyckelteknologi för att dissekera 3D-genomets roll i transkriptionsreglering och därmed celltypsdifferentiering och underhåll.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Christl Gaubitz och Kathleen Stewart-Morgan för deras kritiska läsning av manuskriptet. Vi tackar Anja Groth och Groth-labbet för deras stöd i etableringen av vårt labb. Vi tackar personalen på CPR/reNEW Genomics Platform för stöd: H. Wollmann, M. Michaut och A. Kalvisa. Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW) stöds av Novo Nordisk Foundations anslagsnummer NNF21CC0073729. Novo Nordisk Fondens centrum för proteinforskning (HLR) stöds av Novo Nordisk Fondens anslagsnummer NNF14CC0001. Vi tackar Brickmans labb vid Novo Nordisk Center for Stem Cell Medicine, reNEW Copenhagen, för ES-cellerna hos möss.
1 mM Biotin dATP | Jenna Bioscience | NU-835-Bio14-S | |
1 mM Biotin dCTP | Jenna Bioscience | NU-809-BioX-S | |
10 mM dGTP | NEB | N0442S | |
10 mM dTTP | NEB | N0443S | |
10 U/ml T4 PNK | NEB | M0201L | |
100 U/L Exonuclease III | NEB | M0206L | |
10x NEBuffer 1.1 | NEB | B7001S | |
10x NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | |
10x T4 DNA Ligase buffer | NEB | B0202A | |
1x DPBS w/o Mg2+ and Ca2+ | ThermoFisher | 14190144 | |
1x LIF | |||
2_Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | 0.1 mM b-mercaptoethanol |
37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-500ML | Caution. See manufactures MSDS |
400 U/ml T4 DNA Ligase | NEB | M0202L | |
5 U/ml Klenow Fragment | NEB | M0210L | |
Agarose | BIO-RAD | 1613102 | Caution. See manufactures MSDS |
BSA 20mg/ml | NEB | B9000S | |
CaCl2 | |||
cell counter | |||
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D8418-100ML | Caution. See manufactures MSDS |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | refered to as: magnet magnet for 1.5 ml tubes |
DynaMag-PCR Magnet | Invitrogen | 492025 | refered to as: magnet magnet for PCR tubes |
EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | BioWorld | 40121266-1 | |
Ethanol 96% | VWR Chemicals | 20824365 | quality control system |
Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | |
Ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS) | ThermoFisher | 21565 | |
Fetl Bovin Serum | Sigma Aldrich | F7524 | 15% FBS |
Gel Loading dye purple (6X) | NEB | B7024S | |
Glycine | PanReac AppliChem | A1067.0500 | |
Halt Proteinase inhibitor (100x) | ThermoFisher | 78430 | Caution. See manufactures MSDS |
IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | 18896-50ML | |
MgCl 1 M | Invitrogen | AM9530G | |
Micrococcal Nuclease (MNase) | Worthington | LS004798 | |
mouse embryonic stem cells | |||
NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index primers) | NEB | E7600S | amplification primers for sequencing libraries |
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | NEB | E7645L | sequencing library preparation kit |
NEBNext Ultra II Q5 Master mix | NEB | M0544S | Caution. See manufactures MSDS |
Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | 1x NEAA |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | 1% Pen-Strep |
Proteinase K (40 mg/ml) | GoldBio | P-480-1 | Caution. See manufactures MSDS |
QIAquick Gel extraction kit | QIAgen | 28706 | refered to as: DNA gel elution kit |
QIAquick PCR purification kit | QIAgen | 28106 | refered to as: commercial DNA purification kit |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA quantification instrument |
Quick load purple 1kb plus DNA Ladder | NEB | N0550S | |
SPRIselect size selection beads | Beckman Coulter | B23319 | paramagnetic beads |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | refered to as: thermomixer |
Tris | Merck | 10708976001 | |
Trypsin | |||
Tween20 | Sigma Aldrich | P7949-100ML | |
Ultrapure 10% SDS | Invitrogen | 15553-035 | |
Ultrapure Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol (PCI) | Invitrogen | 15593-031 | |
Fragment Analyzer |