Een instrument en chemicaliën beschreven sequentieel isoleren nucleïnezuren gevolgd door eiwitten van een monster zonder electriciteit. De tool bestaat uit een sorptiemiddel gehouden binnen een transferpipet, terwijl de isolatie chemie zijn gebaseerd op de vaste-fase-extractie principes. De geïsoleerde macromoleculen kan geanalyseerd worden door immuno-gebaseerde en PCR-gebaseerde assays.
Traditionele en nieuwe ziekteverwekkers zoals enterohemorragische Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, of prion-ziekten te zijn van grote zorg voor overheden, industrie en medische professionals over de hele wereld. Bijvoorbeeld, EHECS, in combinatie met Shigella, zijn verantwoordelijk voor de dood van ongeveer 325.000 kinderen per jaar en zijn vooral in de ontwikkelingslanden, waar het laboratorium op basis van identificatie, gebruikelijk in de Verenigde Staten, is niet beschikbaar 1. De ontwikkeling en distributie van lage kosten, zou veld-based, point-of-care tools om te helpen bij de snelle identificatie en / of diagnose van pathogenen of ziekte markers drastisch veranderen progressie van de ziekte en de patiënt prognose. Wij hebben een tool ontwikkeld om nucleïnezuren en eiwitten uit een monster isoleren door vaste-fase-extractie (SPE) zonder elektriciteit of aanverwante laboratoriumapparatuur 2. De geïsoleerde macromoleculen kan worden gebruikt voor diagnosis hetzij in een voorwaartse lab of het gebruik van field-based point-of-care platformen. Belangrijk is dat deze methode voorziet in de directe vergelijking van nucleïnezuur en eiwit gegevens uit een niet-splitsing monster, met een vertrouwen door de bevestiging van genomics en proteomics analyse.
De isolatie gereedschap gebruikt de standaard voor vaste-fase geïsoleerd nucleïnezuur, de BOOM technologie, die nucleïnezuren een chaotropische zoutoplossing, gewoonlijk guanidine isothiocyanaat door binding aan silica gebaseerde deeltjes of filters 3 isoleert. Eigen vaste fase CUBRC de extractie chemie wordt gebruikt om eiwitten te zuiveren van chaotrope zoutoplossingen, in dit geval uit het afval of stroom-through na nucleïnezuursequentie isolatie 4.
Door verpakking chemie gekarakteriseerde in een kleine, goedkope en eenvoudige platform, hebben we een draagbaar gegenereerd voor nucleïnezuur en eiwit-extractie kan worden uitgevoerd onder variety voorwaarden. De geïsoleerde nucleïnezuren zijn stabiel en kunnen worden afgevoerd naar een positie waar vermogen voor PCR amplificatie terwijl het eiwitgehalte kan direct geanalyseerd door gehouden hand of andere immunologische gebaseerde assays. De snelle identificatie van ziekte markers in het veld kan de patiënt uitkomst significant te veranderen door de leiding van de juiste loop van de behandeling in een eerder stadium van de progressie van de ziekte. Het gereedschap en de beschreven methode zijn geschikt voor gebruik met vrijwel alle infectieuze agens en bieden de gebruiker de redundantie van multi-macromolecuul soort analyses en tegelijkertijd de vermindering van de logistieke last.
De tool, chemie en protocol in dit rapport beschreven staan voor de eerste bekende voorbeeld van een elektriciteit-free, multi-macromolecuul extractie systeem dat gebruikt kan worden in het veld op basis van, point-of-care toepassingen. Beide macromolecuul types kan worden toegepast op een aantal verdere diagnostische of analyseapparatuur. Bijvoorbeeld, de geïsoleerde nucleïnezuren van PCR kwaliteit (figuur 2 en 3), terwijl de eiwitbestanddeel van het monster immunoreactieve (figuur 4). Het gebruik van deze extractie systeem in sobere of bron beperkte gebieden van de wereld zou kunnen drastische vermindering van de ziektelast in de bevolking die er wonen. Deze extractie systeem zou ook kunnen helpen bij de ziekte van bewakingsprogramma's over de hele wereld door middel van een robuuste maar snelle en kosteneffectieve methode voor het monster verwerking in sobere of externe locaties.
Een belangrijk aspect van de extractie methode bovengenoemde datkan worden gewijzigd door de gebruiker. Bijvoorbeeld, wanneer steekproef groter of kleiner dan de initiële 500 μLs (stap 1.2), kan de gebruiker instellen van de hoeveelheden van de reagentia daarvan. Dat wil zeggen, de volumetrische verhouding van de reagentia aan de steekproefomvang moet constant blijven, terwijl het volume in absolute zin kan worden gewijzigd. Ook kan aanpassing van het aantal passages over het sorptiemiddel worden gemaakt naar keuze van de gebruiker. Als bijvoorbeeld een groter monstervolume wordt gebruikt, het monster op het sorptiemiddel vaker dan genoemde (stap 2.4 en 3.3) zal de waarschijnlijkheid van het macromolecuul type (nucleïnezuur of een eiwit) het in aanraking sorptiemiddel. De stijging van de passages moeten verhogen efficiëntie vast te leggen totdat sorbent verzadiging is bereikt.
We hebben ontdekt dat de extractie tool en de bijbehorende chemie een aantal beperkingen, de belangrijkste daarvan is dat het eiwit-extractie chemie is inefficiënt voor het herstel van zeer geglycosyleerd hebbeneiwitten. In het geval dat de verdere diagnostische een geglycosyleerd eiwit gericht kan dit stelsel niet geschikt voor identificatie. Bovendien worden de bovenste en onderste grens van extractie efficiënties voor een nucleïnezuren of eiwitten nog bepaald en optimalisatie gang om herstel te maximaliseren. Verdere ontwikkeling van het instrument zal het overwinnen van deze huidige kennis hiaten.
The authors have nothing to disclose.
De financiering voor de ontwikkeling van de winning pipet werd verstrekt in het kader van een intern onderzoek en ontwikkeling subsidie voor DRP.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Guanidine Thiocyanate | Teknova | G4000 |
ethanol | Pharmco-Aaper | 11ACS200 |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L |
BSA | Sigma | A-4503 |