חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון
Summary
כלי ו chemistries מתוארים ברצף כדי לבודד חומצות גרעין ואחריו חלבונים ממדגם ללא צורך בחשמל. כלי מורכב sorbent שנערך בתוך פיפטה העברת בעוד chemistries בידוד מבוססים על עקרונות מוצק בשלב החילוץ. מקרומולקולות את בודדים ניתן לנתח על ידי מבחני חיסונית מבוססי PCR מבוסס.
Abstract
פתוגנים מסורתיים ומתפתחים כגון Escherichia coli Enterohemorrhagic (EHEC), pestis Yersinia, או הפריון מבוססי מחלות הם דאגה משמעותית עבור ממשלות, תעשיות ואנשי מקצוע רפואיים ברחבי העולם. לדוגמה, EHECs, בשילוב עם Shigella, אחראים למותם של כ 325,000 ילדים בכל שנה, והם נפוצים במיוחד בעולם המתפתח בו מעבדה מבוססי זיהוי, נפוץ בארצות הברית, אינו זמין 1. פיתוח והפצה של עלות נמוכה, בתחום מבוססות, הצבע של טיפול כלים כדי לסייע בזיהוי מהיר ו / או אבחון של פתוגנים או סמני המחלה יכולים לשנות באופן משמעותי את התקדמות המחלה ואת הפרוגנוזה לחולה. פיתחנו כלי לבודד חומצות גרעין וחלבונים ממדגם על ידי מיצוי מוצק שלב (SPE) ללא חשמל או הקשורים ציוד מעבדה 2. מקרומולקולות את מבודדות יכול לשמש diagnoSIS או במעבדה קדימה או באמצעות מבוססי בשדה נקודות של טיפול פלטפורמות. חשוב לציין כי שיטה זו מספקת לצורך השוואה ישירה של חומצות גרעין חלבון נתונים ממדגם בלתי מפוצלת, מציע ביטחון דרך אישורו של ניתוח גנטי ו proteomic.
כלי הבידוד שלנו מנצל את תקן התעשייה עבור בידוד מוצק בשלב חומצות גרעין, הטכנולוגיה בום, המבודד חומצות גרעין מפתרון מלח chaotropic, בדרך כלל isothiocyanate guanidine, באמצעות קשירה סיליקה מבוססי חלקיקים או מסננים 3. מוצק בשלב כימיה הקניינית של CUBRC החילוץ משמש לטיהור חלבונים מפתרונות מלח chaotropic, במקרה זה, מפסולת או זרימת-thru בעקבות בידוד חומצות גרעין 4.
לפי האריזה היטב מאופיין chemistries לפלטפורמה קטן, זול ופשוט, אנו יצרו מערכת ניידת של חומצות גרעין להפקת חלבון זה יכול להתבצע תחת variety של תנאים. חומצות גרעין מבודדים יציבים יכול להיות מועבר למצב שבו הכוח זמין עבור הגברה PCR בעוד תכולת החלבון יכול להיות מנותח באופן מיידי על ידי כף יד או אחרים של מערכת החיסון מבוסס מבחני. זיהוי מהיר של סמני המחלה בתחום יכול לשנות באופן משמעותי את התוצאה של המטופל על ידי הפניית כמובן נכון של הטיפול בשלב מוקדם יותר של התקדמות המחלה. כלי בשיטה המתוארת מתאימים לשימוש עם כל גורם כמעט זיהומיות ולהציע למשתמש יתירות של רב מקרומולקולה ניתוחים מסוג תוך צמצום הנטל הלוגיסטי שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
, הכלי chemistries והפרוטוקול המתוארים בדוח זה מייצגים את הדוגמה הידועה הראשונה של מערכת החשמל ללא רב מקרומולקולה, חילוץ, כי יכול להיות מנוצל בתחום מבוססות, הצבע של טיפול יישומים. שני הסוגים מקרומולקולה ניתן ליישם במספר מכשירי אבחון אנליטי או במורד הזרם. כך, למשל, חומצות גרעין בודדים הם בעלי איכות PCR (תרשים 2 ו – 3) ואילו מרכיב החלבון של המדגם הוא immunoreactive (איור 4). ניצול של מערכת זו החילוץ באזורים מוגבלים צנועים או משאב של העולם יכול להפחית באופן דרסטי את נטל המחלה על אוכלוסיות המתגוררות שם. מערכת השאיבה יכולה גם לסייע מעקב תוכניות מחלות ברחבי העולם על ידי מתן השיטה היעילה חזקים עדיין מהיר עלות עיבוד המדגם במקומות צנועים או מרוחק.
היבט אחד חשוב שיטת החילוץ שתואר לעיל הוא כיזה יכול להיות שונה על ידי המשתמש. לדוגמה, במקרים שבהם גודל מדגם גדול יותר או פחות מ -500 μLs הראשונים (שלב 1.2), המשתמש יכול להתאים את כמויות של חומרים כימיים בהתאם. כלומר, היחס בין נפח של ריאגנטים את גודל המדגם צריך להישאר קבוע, בעוד כמויות מוחלטות ניתן לשנות. כמו כן, התאמות במספר קטעים מ sorbent יכול להיות גם על פי שיקול דעתו של המשתמש. לדוגמה, אם נפח דגימה גדול יותר משמש, להעביר את המדגם על פני יותר פעמים מאשר sorbent הרשומים (שלבים 2.4 & 3.3) יגדיל את הסיכוי של סוג מקרומולקולה (חומצת גרעין או חלבון) קשר sorbent. הגידול קטעים צריך להגדיל את יעילות ללכוד עד רוויה sorbent הוא הגיע.
מצאנו כי הכלי כריה chemistries הקשורים יש מספר מגבלות, המשמעותי ביותר מהם הוא כי כימיה מיצוי החלבון אינה יעילה להחלמה של glycosylated ביותרחלבונים. במקרה של אבחון במורד מטרות חלבון glycosylated, מערכת זו לא יכול להיות אידיאלי עבור זיהוי. בנוסף, הגבולות העליונים והתחתונים של יעילות מיצוי לאף חומצות גרעין או חלבונים עדיין נקבע, ואופטימיזציה מתנהלת על מנת למקסם את יעילות השיקום. פיתוח נוסף של הכלי יהיה להתגבר על פערי ידע הנוכחיים.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון לפיתוח פיפטה החילוץ נמסר בחלקו על ידי מחקר פנימי מענק פיתוח הוענק DRP.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Guanidine Thiocyanate | Teknova | G4000 |
| ethanol | Pharmco-Aaper | 11ACS200 |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L |
| BSA | Sigma | A-4503 |
Referências
- Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005. Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).
- Pawlowski, D. R. Extraction Pipette. United States Patent and Trademark Office. , (2010).
- Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. Method and Device for Isolating a Protein Sample. United States Patent and Trademark Office. , (2010).
- Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).
- O’Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea. Science. 226, 694-696 (1984).
- Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain. Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).
- Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages. DNA Research. 6, 141-143 (1999).
- Ptashne, M. . A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , (2004).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).
- Feng, P., Monday, S. R. Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes. Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).
