Электричество-Free, последовательное нуклеиновых кислот и белков изоляции

Выделение нуклеиновых кислот: Изолированные нуклеиновые кислоты ПЦР усиливаемых и без белка загрязнения. Пример 1: восстановленные нуклеиновых кислот, которые пригодны для использования в ПЦР-приложений. Например, на рисунке 2 показано усиление Шига токсина генов, связанных с Энтерогеморрагическая E. палочки O157: H7 штамм EDL-933 (АТСС # 35150) от нуклеиновой кислоты / экстракции белков процедуры с помощью пипетки добычи. Токсин Шига генов STX 1 и STX 2 находятся на умеренном лямбда-бактериофага, как и дефектных бактериофагов в этом и других Энтерогеморрагическая E. штаммов кишечной под контролем промотора Р 5 6 7 8. Активация ответ SOS в E. палочки приводит к индукции профага и / или токсинов 9. Мы использовали модифицированную версию мультиплексный ПЦР Фэн и др. 1.1 выявить STX 1 и STX 2 гена в культуру и шипами образцы сточных вод. Дорожки и B на рисунке 2 представлены результаты ПЦР на необработанные образцы культуры (переулок), а также обработанные образцы культуры (полоса B). Эти результаты практически идентичны смысла нет потери качества в обработанном или изолированных нуклеиновых кислот. Далее усиливается шипами неочищенных сточных вод (полоса D) или изолированных нуклеиновых кислот с шипами сточных вод (полосы E и F). Эти данные свидетельствуют о том, что изолированные нуклеиновых кислот в результате большее усиление по сравнению с неизолированными нуклеиновых кислот с шипами образцы сточных вод. Поэтому мы делаем вывод, что либо ингибиторы ПЦР, естественно, в сточные воды были удалены по отдельности или, что нуклеиновые кислоты были сосредоточены на изоляцию. Сочетание этих двух гипотез также возможно. Ультрафиолетовая спектроскопия следующий показано, что изолированные нуклеиновых кислот были относительно свободными ое загрязняющих белков. На рисунке 3 показана УФ-спектры двух E. палочки O157: H7, нуклеиновые кислоты экстракции, обозначенные изоляции и изоляции б, в сравнении с нормированным спектром бактериальных культур, обозначенные заранее изоляции. УФ-спектров выделенных нуклеиновых кислот напоминает спектры чистых нуклеиновых кислот, имеющих рассчитывается коэффициент абсорбции между 260 нм и 280 нм приближается 1,8 10. Эти данные показывают, что существует очень мало загрязняющих белка в нуклеиновой кислоте фракция восстановить, используя методику, описанную. Белки изоляции: Восстановленные белка из нуклеиновой кислоты / белок изоляции эксперимент иммунореактивного и электрофореза идентичны чистого белка. Пример 2: Изолированная часть белка была применена к RapidChek E. палочки O157 боковой поток анализа полосы (SDIX, Inc.) Управление показать позитивную идентификацию во всех образцах укрывательство E. палочки O157, с или без STX индукции (рис. 4, дорожки B и C, соответственно). Данные на рисунке 4 также показывают положительные результаты для этих образцов укрывательство E. палочки O157, которые были обработаны для нуклеиновых кислот и белков, то использование добыча пипетки. Эти данные показывают, что изолированные белки от каждого образца иммунореактивного спровоцировав тем самым положительный ответ. ПЦР-амплификации (как описано в примере 1) был выполнен на белок образцы, чтобы показать, что изолированная часть белка была лишена загрязняющих нуклеиновых кислот. Результаты этих экспериментов были отрицательными помощью гель-электрофореза. Таким образом, можно заключить, что содержание белка в образце была отделена от загрязнения нуклеиновых кислот. Эти результаты, взятые в целом, с описанным в нуклеиновой кислоте изоляции шаг показывает, что нуклеиновые кислоты и белка изолированы в отдельных этапах фракционирования. т "> Пример 3. Выделенный белок подходит для электрофореза 10 Рисунок 5 изображает Кумасси окрашивали 8% акриламида гель загружается с BSA (рис. 5, дорожки и C) и BSA изолированы от 6М гуанидин изотиоцианат помощью пипетки добычи и связанных с ним протокол. электрофоретической подвижности выделенных белков идентична контрольных образцов. Таким образом, заключить, что процесс извлечения не изменяет ковалентной структуры изолированного белка. На рисунке 1, Группа A: изображение типичного нуклеиновые кислоты процедура извлечения образца смешивают с 6M гуанидина тиоцианата в пробирку и перешел сорбента в пять раз.. После последнего прохода, образец добавляется в буфер извлечения белка. Сорбента и связанных нуклеиновых кислот дважды промывают этанолом. Затем образец воздуха гРид и вымывают из сорбента. На рисунке 1, Группа B: изображение типичная процедура извлечения белка образец смешивается с белком изоляции буфере с шагом 1, рисунок 1, панель передается через сорбент второй пипетки добычи в 15 раз.. Остальная процедура идентична нуклеиновых кислот протокол добычи. Рисунок 2:. Отрицательные картину бромистого этидия окрашенных агарозном геле мультиплексированных Шига токсин 1 и 2 амплификации гена эксперимент проводили с использованием образцов культуры (полосы А и В) или сырые образцы сточных вод с шипами E. палочки O157: H7 (полосы D, E и F). Образцы были непосредственно добавлены трубы реакции ПЦР (полосы и D) или образцы обрабатываются с помощью изоляции процессорыс, а извлечь нуклеиновые кислоты были добавлены к трубе реакции ПЦР (образцы B, E и F). ПЦР протокол является модификацией описанного Фэн и др. 11. Наша модификация предназначена только те, усиливается STX 1 (нижняя полоса) и STX 2 (верхний диапазон) пары праймеров, сбросив все другие пары праймеров. Лейн С 1Кб лестница из BioRad. Рисунок 3: Результаты УФ-спектроскопии Е. палочки O157: H7, нуклеиновые кислоты выделяли с помощью пипетки сообщил добычи изолированных нуклеиновых кислот помечены изоляции и изоляции б.. УФ-спектр образца и испытания до нуклеиновых кислот и обозначен заранее изоляции. Спектры были получены с использованием Hitachi U3010 спектрофотометр и связанных с ним программного обеспечения. <br/> Рисунок 4. Цветное фото полос RapidChek тест Содержание белка в образцах на рисунке 2 выделяли с помощью пипетки добычи и протестированы для иммунной реактивности боковыми анализа потока. Переулки AC необработанные управления, то есть культуры клеток был добавлен в тест-полоску без нуклеиновой кислоты или белка добычи. Лейн является E. палочки BL21 DE3 pLysS в качестве отрицательного контроля, дорожки B и C шоу E. палочки O157: H7, которая была необработанной (B), или обработаны митомицином С в течение 4 часов (C). Дорожки через D H показать результаты добавления извлеченного белка боковой тест-полосок потока. Переулки D и Е были исследованы использование белкового экстракта из Е. палочки BL21 DE3 pLysS либо без (D) или митомицином С лечение (E) как отрицательный контроль. Переулки FH показать результаты после извлечения белка из Е. палочки O157: H7 был использован. Белка была извлечена из необработанной (F), или 2 часа (G) или 4 часа (H) обработанными митомицином С культур.Положительные результаты производить двойной красной линией. Рисунок 5. Фотография окрашенных Кумасси SDS-PAGE BSA была изолирована от решения с помощью пипетки добычи и описаны протоколы. Дорожки и С являются контроль полосы 250 мкг / мл и 500 мкг / мл соответственно. Переулки B и D показывают восстановленные BSA из растворов, содержащих же концентрациях, что и соответствующие элементы управления.