免电力，顺序的核酸和蛋白质的分离
Summary
工具和化学描述顺序隔离没有对电力的需要，由蛋白质样品的核酸。该工具由吸附剂而隔离化学固相萃取原则的基础上，移液管内举行。孤立的大分子可以基于免疫和基于PCR的检测分析。
Abstract
传统和新兴的病原体，如肠出血性大肠杆菌 （EHEC）， 鼠疫菌，或朊病毒疾病的重大关切，为政府，行业和世界各地的医疗专业人员。例如，相结合，与志贺氏菌 EHECs，每年约325,000名儿童的死亡负责，特别是在发展中世界的实验室为基础的识别，在美国常见的，是不可用1普遍。低成本的发展和分布，实地为基础，点保健工具，以帮助快速识别和/或病原体或疾病标志物的诊断可以大大改变疾病的进展和病人的预后。我们已经开发出一种工具来分离固相萃取（SPE）从样品中的核酸和蛋白质，没有电力或相关的实验室设备2。孤立的大分子，可用于diagno无论是在前进的实验室或使用现场设点的护理平台SIS。重要的是，这种方法提供了直接从联合国分裂的样本核酸和蛋白质数据的比较，通过对基因组和蛋白质组分析的佐证提供的信心。
我们的隔离工具，采用固相核酸分离的行业标准，繁荣技术，分离离液盐的解决方案，通常是异硫氰酸胍，通过结合基于硅粒子或过滤器3，核酸。 CUBRC专有的固相萃取化学，用于纯化蛋白，离液盐溶液在这种情况下，从废物或流通过继核酸隔离4。
由包装特色的化学成一个小，价格低廉，简单的平台，我们已经产生了核酸和蛋白提取的便携式系统，可以根据VAR进行iety的条件。孤立核酸是稳定的，可以运到一个位置，电源可用于PCR扩增，而蛋白质含量可以立即举行的手或其他免疫检测分析。在该领域的疾病标志物的快速鉴定，能显着改变指导适当的治疗过程中病情恶化的早期阶段，病人的结果。的工具和方法，适用于几乎任何传染性病原体使用，并为用户提供多高分子型分析的冗余，同时减少他们的后勤负担。
Protocol
1。样品裂解样品应在液态形式。如果样品是固体，例如食物或粪便样本，应暂停在液体介质，例如水或磷酸盐缓冲液（PBS）。 混合样品500μL，500μL6M胍硫氰酸盐（pH值6.5）1.5 mL管。 压低提取移液器灯泡，驱逐了周围的空气。 拉入整个1毫升样品提取移液器，在吸附材料，通过让球慢慢地扩大。 反转的提取工具等吸附剂珠和样品漏入灯泡。 磨灯泡小心不要驱逐提取移液器样品样本的吸附剂珠。 2。核酸提取（ 图1，A组） 反转的提取移液器（开放向下）和驱逐到原来的1.5毫升管样品。 <李>提取移液器拉进整个1毫升样品，通过在吸附剂，在一个适度的速度，小心地保持在颈部提取移液器吸附剂。 按下灯泡驱逐到1.5 mL管整个样本。 重复步骤2.2和2.3，通过吸附剂四次，共5科及格的样本。 在吸附剂的第五通后，驱逐到的蛋白质提取液（15 mL锥形管）4ML整个1毫升样品，关闭管，留作以后使用。 1毫升95％的乙醇通过吸附剂的三倍以上，回国后，最后通过乙醇到其原始的管洗孤立的核酸。 使用第二个1毫升，95％的乙醇洗，重复步骤2.6。 按下和释放5分钟的灯泡，通过整个提取吸管周围空气干燥的核酸/吸附剂床。擦拭残留的乙醇提取移液器ü尖唱一个Kimwipe。 通过250μL10毫米的Tris（pH 6.8）的吸附剂五倍恢复核酸。 Tris缓冲液，可以换成任何其他合适的，如PBS水溶液。最终的解决方案包含提取核酸。 3。蛋白提取（图1，B组） 混合反演2.5步的样品和蛋白提取液管，并通过在一个新的提取移液器吸附剂大约两到三年的这5毫升样品毫升。 驱逐到同一个15mL的锥形管小心地保持在颈部提取移液器吸附剂整个样本。 重复步骤3.1和3.2的样品，通过吸附剂的15倍以上。 洗三次，喷射到它的原始管乙醇1毫升95％的乙醇通过吸附剂床的吸附剂和结合蛋白。 使用第二个1毫升，95％的乙醇洗，重复步骤3.4。 按下和释放5分钟的灯泡，通过整个提取吸管环境空气干燥蛋白/吸附剂床。擦拭残留的乙醇提取使用kimwipe吸管尖。 恢复通过吸附剂五倍以上的PBS 250μL蛋白。 PBS缓冲液，可以换成任何其他合适的，如10毫米三（pH值6.8）的水溶液。最终的解决方案包含了样品的蛋白质含量。 图1。 图2。 图3。 图4。 内容“> 图5。
Representative Results
核酸分离：隔离核酸PCR扩增和蛋白污染的自由。 例1：回收的核酸适合PCR为基础的应用。例如， 图2显示了肠出血性大肠杆菌志贺毒素相关基因的扩增大肠杆菌 O157：H7大肠杆菌的EDL-933（ATCC＃35150）从核酸/蛋白的提取，使用提取移液器的过程。在这个和其他肠出血性大肠杆菌，志贺毒素STX 1 STX 2的基因被发现在温带的拉姆达样噬菌体，缺陷噬菌体控制下的P R的启动5 6 7 8 大肠杆菌菌株。在大肠杆菌中的SOS反应的激活大肠杆菌导致噬菌体的诱导和/或产生毒素9。我们利用丰等复用的PCR检测的修改后的版本1。1，以确定STX 1和STX 2基因在文化和尖刺的污水样本。车道和图2中的 B显示了未处理的文化样本（一个车道）的PCR扩增和处理文化样本（车道）的结果。这些结果是几乎相同的意义，有没有保真度损失在加工或孤立的核酸。接下来我们放大的尖刺未经处理的污水（双线四）或孤立核酸从尖刺污水酸（车道E和F）。这些数据表明，孤立核酸造成更大的与从尖刺污水样本的非隔离的核酸扩增。因此，我们得出这样的结论：要么PCR自然发现污水抑制剂被拆除后，隔离或核酸分离后集中。这两个假设的组合也是可行的。 未来紫外光谱表明，孤立核酸相对自由Øf污染蛋白。 图3显示了两个大肠杆菌的紫外光谱大肠杆菌 O157：H7型核酸酸提取，标记和隔离，隔离细菌培养的规范化谱，标记隔离前相比。孤立核酸的紫外吸收光谱类似于纯的核酸，有接近1.8 10 260 nm和280 nm之间的比例计算的吸收光谱。这些数据表明，有很少的污染蛋白质在核酸回收使用的技术描述部分。 蛋白质分离回收蛋白核酸/蛋白分离实验是纯蛋白质的免疫反应和电泳相同。 例2：分离蛋白组分应用的RapidChek E.大肠杆菌 O157横向流动检测条（SDIx上，公司）。控制显示在所有样品窝藏大肠杆菌阳性鉴定大肠杆菌 0157，带或不带感应世腾（ 图4，分别车道乙和Ç）。 图4中的数据还显示，对于那些窝藏大肠杆菌样本的阳性结果大肠杆菌 O157核酸，然后用蛋白提取移液器处理。这些数据表明，从每个样品的分离蛋白是免疫反应，从而引发了积极的回应。 表明，分离蛋白分数是没有污染的核酸，蛋白质样品进行PCR扩增（如例1中所述）。这些实验的结果均为阴性凝胶电泳。因此，我们得出这样的结论：样品的蛋白质含量污染核酸分离。这些结果，在与核酸分离步骤表明，核酸和蛋白质含量分离在不同的分馏步骤中描述的整体。 T“>例3：分离蛋白是适合电泳10 图5描述了1考马斯亮蓝染色8％丙烯酰胺凝胶从6M胍异硫氰酸使用吸管和相关提取分离与牛血清白蛋白（ 图5，通道A和C）和BSA加载协议。分离蛋白的电泳迁移率是控制样品相同，因此，我们得出这样的结论：提取过程中不改变分离蛋白的共价结构。 图1中，A组：混合样品在样品管与6M胍硫氰酸和吸附剂五倍通过描写一个典型的核酸提取过程。最后一段后，样品被加入蛋白提取液。吸附剂和结合的核酸用乙醇洗两次。样品是空气ð里德和吸附剂洗脱。 图1，面板A：一个典型的蛋白提取过程的描写，从步骤1， 图1中 ，委员会第二次提取移液器15倍以上的吸附剂通过与蛋白质隔离缓冲混合样品。该过程的其余部分是相同的核酸提取协议。 图2：溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶负图片一个复用的志贺毒素1和2基因扩增实验，进行文化样本（通道A和B）或未经处理的污水样品添加与E.大肠杆菌 O157：H7型（车道D，E和F）的。样品被直接添加到PCR反应管（通道A和D）或样品进行了处理使用的隔离议事录和核酸提取到PCR反应管（样品B，E和F）。 PCR的协议是由丰等 11描述的修改。我们的修改只针对那些STX 1（低频段）和STX 2（上带）对引物扩增，所有其他的引物对辍学。巷C是1KB梯子从BioRad公司。 图3：E.紫外光谱结果大肠杆菌 O157：H7型核酸分离使用的报告提取移液器孤立核酸标记隔离A和隔离B。样品的紫外光谱测试之前，核酸提取和标记前隔离。光谱获得使用日立U3010分光光度计和相关的软件包。 <br/> 图4：彩色照片的RapidChek试纸图2中使用的样品的蛋白质含量分离提取移液器和横向流动检测免疫反应的测试。车道交流未处理的控制，细胞培养，加入无核酸或蛋白质提取试纸。弄一个是E。大肠杆菌 BL21 DE3 pLysS中作为阴性对照，泳道B和C显示大肠杆菌大肠杆菌 O157：H7的是未经处理的（B），或与丝裂霉素C（C）4小时处理。通过H车道ð显示提取的蛋白，以增加横向流动试纸的结果。车道D和E分别探讨了利用大肠杆菌蛋白提取物要么没有（D）或（E）为阴性对照丝裂霉素C治疗大肠杆菌 BL21 DE3 pLysS中。车道跳频结果显示，当从大肠杆菌中提取蛋白大肠杆菌 O157：H7使用。蛋白提取未经处理的（F），或从2小时（G）或4小时（H）丝裂霉素C处理文化。阳性结果产生双红线。 图5：照片的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE BSA的分离提取移液器和描述协议的解决方案。车道A和C是250微克/毫升和500微克/毫升，分别控制车道。 B和D车道描绘康复牛血清白蛋白，从含有相同浓度为各自控制的解决方案。
Discussion
在本报告所述的工具，化学和协议代表的电力，多场为基础的，点保健应用，可以利用的高分子萃取体系的第一个众所周知的例子。两种高分子类型，可以应用到下游的诊断或分析设备的数量。例如，孤立核酸PCR的质量（ 图2和3），而样品中的蛋白质成分是阳性（ 图4）。利用该萃取体系在严峻的世界或资源有限的地区，可以大大减少疾病的人口生活在那里的负担。此萃取体系也有助于在世界各地的疾病监测方案，通过提供一个强大而快速和成本有效的方法，在严峻或偏远地区的样品处理。
其中一个重要方面上文所述的提取方法是，它可以由用户修改。例如，在情况下，样本大小是大于或小于最初的500μLs（步骤1.2），用户可以调整相应的试剂量。也就是说，试剂的体积比为样本大小可以改变，而绝对量应保持不变。此外，在吸附剂的通道数的调整，也可以在用户的自由裁量权。例如，如果使用一个较大的样本量，通过吸附剂以上的上市时间（步骤2.4：3.3），样品将增加高分子型接触的吸附剂（核酸或蛋白质）的可能性。在通道的增加，应提高捕捉效率，直至达到吸附饱和。
我们发现，提取工具和相关的化学物质有一定的局限性，其中最重要的是恢复高度糖化蛋白萃取化学低效蛋白质。在事件下游的诊断针对的是一种糖蛋白，该系统可能无法识别的理想。此外，无论是核酸或蛋白质提取效率的上限和下限仍然被确定，正在进行和优化，以最大限度地回收效率。进一步发展的工具，将克服这些现有的知识差距。
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
提取移液器发展提供了资金部分由内部研究发展补助金，并授予的DRP。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Guanidine Thiocyanate | Teknova | G4000 |
| ethanol | Pharmco-Aaper | 11ACS200 |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L |
| BSA | Sigma | A-4503 |
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Citar este artigo
Pawlowski, D. R., Karalus, R. J. Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation. J. Vis. Exp. (63), e4202, doi:10.3791/4202 (2012).