Elektrik-Free, Sıralı Nükleik Asit ve Protein İzolasyonu

Nükleik Asit İzolasyon: İzole nükleik asitlerin PCR amplifiable ve protein kontaminasyon ücretsizdir. Örnek 1: kurtarılmış nükleik asitler PCR bazlı uygulamalarda kullanım için uygundurlar. Örneğin, Şekil 2 ile ilişkili Enterohemorrhagic E. shiga toksini genlerinin büyütülmesi gösterir coli O157: ekstraksiyon pipet kullanarak bir nükleik asit / protein ekstraksiyon usul H7 suşu EDL-933 (ATCC # 35150). Shiga toksin genleri stx 1 ve 2 stx Bu ve diğer Enterohemorrhagic E. ılıman lambda benzeri bakteriyofaj ve kusurlu bakteriyofaj bulunur P R organizatörü 5 6 7 8 kontrolü altında coli. E. SOS tepkisinin aktivasyonu coli indüksiyonu ve / ya da toksin üretimi 9 profaj yol açar. Biz Feng ve arkadaşları tarafından çoğaltılmış PCR değiştirilmiş bir versiyonu kullanılmıştır ettik. 11 kültür ve çivili kanalizasyon örneklerinde hem stx stx 1 ve 2 genleri tanımlamak için. Şeritlerinin Şekil 2'de A ve B, bir işlenmemiş kültürü örneği (şeritli A) bir PCR büyütmesi ve işlenmiş bir kültür örneği (şerit B) sonuçlarını göstermektedir. Bu sonuçlar hemen hemen aynı anlamı olan işlenmiş veya izole nükleik asitlerin aslına kaybı yoktur. Önümüzdeki çivili ham kanalizasyon (şerit D) ya da kirpi kanalizasyon izole edilen nükleik asitler (şerit E & F) çoğaltıldı. Bu veriler, izole nükleik asitler kirpi lağım örnekleri non-izole nükleik asitler karşı daha büyük bir amplifikasyon yol açtığını göstermektedir. Bu nedenle doğal kanalizasyon bulunan PCR inhibitörleri ya izolasyonu üzerine kaldırılmış olduğunu veya nükleik asitlerin izolasyonu üzerine yoğunlaşmıştır sonucuna vardık. Bu iki hipotez bir kombinasyonu da mümkündür. Ultraviyole spektroskopisi sonraki izole nükleik asitler görece özgür olduğumuzu göstermek için kullanılan of kontamine protein. Şekil 3 İki E. UV spektrumları gösterir coli O157: H7 nükleik asit ekstraksiyon, etiketli bir izolasyon ve yalıtım, b öncesi izolasyon etiketli bakteriyel kültür normalize spektrum göre. İzole nükleik asitlerin UV spektrumu 260 nm ve 1,8 10 yaklaşırken 280 nm arasındaki bir absorbans hesaplanan oranına sahip olan saf bir nükleik asitlerin spektrumları benzemektedir. Bu veriler, açıklanan yöntem kullanılarak elde edilen nükleik asitin fraksiyonu içinde çok az protein kirletici olduğunu göstermektedir. Protein İzolasyon: nükleik asit / protein izolasyonu deney Kurtarıldı protein immunoreaktif ve saf protein elektroforetik aynıdır. Örnek 2: izole protein parçası RapidChek E. uygulanmıştır coli O157 yanal akış testi şeritler (SDIX, Inc.) Kontroller E. barındıran tüm örneklerde pozitif bir kimlik göstermek coli Veya STX indüksiyon (Şekil 4, sırasıyla, şerit B ve C), olmadan O157,. Şekil 4'te veriler de E. barındıran bu numuneler için olumlu sonuçlar ekstraksiyon pipet kullanılarak nükleik asitlerin ve daha sonra protein için işlendi coli O157. Bu veriler, her numuneden izole proteini ve böylece bir pozitif tepki tetikleme immünoreaktif olduğunu göstermektedir. PCR amplifikasyonu (Örnek 1 'de açıklandığı gibi) izole edilmiş protein fraksiyonu nükleik asitler kirletici yoksun olduğunu göstermek için protein numuneler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu deneyler için sonuçlar jel elektroforezi bütün negatifti. Böylece, örnek protein içeriği nükleik asitler karışmasını ayrıldı sonucuna vardık. Bu sonuçlar, nükleik asitlerin ve protein içeriği ayrı bir fraksiyonlara ayırma aşamada izole edilmektedir ki nükleik asit tecrit adım göstermek için tarif edilenler ile bütün olarak alınmıştır. t "> Örnek 3:. izole protein elektroforezi 10 için uygun olan Şekil 5, bir Coomassie ekstraksiyon pipet kullanılarak ve ilişkili 6M guanidin izotiyosiyanat izole BSA (Şekil 5, şerit A ve C) ve BSA ile yüklenir 8% akrilamid jel boyanmış tasvir protokolü. izole protein elektroforetik mobilite kontrol örnekleri ile aynıdır. Biz böylece çıkarma işlemi izole protein kovalent yapısını değiştirmez sonucuna vardık. Şekil 1, Panel A: Tipik bir nükleik asit ekstraksiyon prosedürü tasviri örnek örnek tüp içinde 6M guanidin tiyosiyanat ile karıştırılır ve sorbent beş kat üzerinden geçirilir.. Son bir geçişten sonra, numune proteini ekstraksiyon tamponu ilave edilir. Sorbent bağımlı ve nükleik asitlere etanol ile iki kez yıkanır. Örnek sonra hava dısrarcıyız ve emici gelen elüt. Şekil 1, Panel B: tipik bir protein ekstraksiyon prosedür Tasvir adım 1, Şekil 1, bir ikinci bir ekstraksiyon pipetle 15 kat emici üzerinden geçer panelinden proteinin izole tamponu ile karıştırılır Örnek.. Prosedürün kalanı nükleik asit ekstraksiyon protokolü ile aynıdır. Şekil 2:. Bir etidyum bromür ile boyanan agaroz jel Negatif resmi bir çoğaltılmış shiga toksin 1 ve 2 gen amplifikasyonu deney E. ile çivili kültür örnekleri (şerit A ve B) veya ham kanalizasyon örnekleri kullanılarak yapıldı coli O157: H7 (şerit D, E ve F). Örnekleri, ya doğrudan bir PCR reaksiyonu tüp (şeritlerinin A ve B) veya örnekleri ilave edildi izolasyonu süreç ile işlendis ve ekstre nükleik asitler PCR reaksiyonu tüp (Örnekler B, E ve F) ilave edildi. PCR protokolü Feng ve ark 11 tarafından tarif birinin bir modifikasyonudur. Bizim modifikasyon diğer tüm primer çiftleri bırakıp sadece stx 1 (alt bant) ve stx 2 (üst bant) primer çiftleri ile çoğaltıldı bu hedef. Lane C BioRad gelen 1 kB'lık merdiven. Şekil 3: E. UV spektroskopi sonuçları coli O157: H7 nükleik asitler bildirilen ekstraksiyon pipet kullanılarak izole izole nükleik asitlerin izolasyonu ve izolasyon b etiketlenir.. Numunenin UV spektrumu da önceden nükleik asit çıkarımı ile test edildi ve pre-izolasyonu etiketlenmiştir. Spektrası, bir Hitachi U3010 spektrofotometre ile ilgili yazılım paketi kullanılarak elde edilmiştir. <br/> Şekil 4:. RapidChek test şeritleri Renkli fotoğraf Şekil 2'de kullanılan örneklerinin protein içeriği ekstraksiyon pipet kullanılarak izole ve yanal akış testi ile immün reaktivite açısından test edilmiştir. Lanes AC, hücre kültürü nükleik asit ve protein çıkarma olmadan test şeridi eklendi edilir işlenmemiş kontrolleri vardır. Lane A E. olduğu negatif kontrol olarak E.coli BL21 de3 pLysS, Lanes B ve C gösterisi E. coli O157: (B) veya 4 saat boyunca mitomisin C (C) ile muamele edilmeyen idi H7. H ile Lanes D yanal akış test bantları için çıkarılan protein ilave sonuçlarını göstermektedir. Lanes D ve E E. protein ekstraktı kullanılarak probed edildi ya (D) olmadan veya negatif kontrol olarak mitomisin C tedavisi (E) ile coli BL21 de3 pLysS. E. protein ayıklandığında FH sonuçlarını göstermek Lanes coli O157: H7 kullanılmıştır. Proteini (F) arıtılmamış, ya da 2 saat (G) veya 4 saat (H) mitomisin C tedavi edilen kültürden ekstrakte edildi.Pozitif sonuçlar bir çift kırmızı çizgi üretirler. Şekil 5:. Bir Coomassie lekeli Fotoğraf SDS-PAGE BSA çıkarma pipet ve açıklanan protokolleri kullanarak çözüm izole edildi. Şeritlerinin A ve C, sırasıyla 250 ug / ml ve 500 ug / mL 'lik kontrolü şeritleri vardır. Şerit B, D, ilgili kontrol olarak aynı konsantrasyonlarını ihtiva eden çözeltiler elde BSA tasvir etmektedir.