Electricidad-libre, el ácido nucleico secuencial y aislamiento de las proteínas

Aislamiento de ácidos nucleicos: los ácidos nucleicos son aislados PCR amplificable y libre de contaminación de proteínas. Ejemplo 1: Los ácidos nucleicos recuperados son adecuados para uso en aplicaciones basadas en la PCR. Por ejemplo, la Figura 2 muestra la amplificación de genes de la toxina shiga asociados con enterohemorrágica E. coli O157: H7 EDL-933 (ATCC # 35150) a partir de un procedimiento de extracción de ácido nucleico / proteína con la pipeta de extracción. Los genes de la toxina shiga stx 1 y stx 2 se encuentran en templado lambda bacteriófago como bacteriófago defectuoso y en ésta y otras enterohemorrágica E. cepas de E. bajo el control del promotor P R 5 6 7 8. La activación de la respuesta SOS en E. E. conduce a profago inducción y / o producción de toxinas 9. Hemos utilizado una versión modificada del ensayo de PCR multiplexada por Feng et al. 11 para identificar el stx 1 y genes stx 2, tanto en la cultura y muestras adicionadas de aguas residuales. Los carriles A y B en la Figura 2 se muestran los resultados de una amplificación por PCR de una muestra de cultivo sin procesar (carril A) y una muestra de cultivo procesado (carril B). Estos resultados son prácticamente idénticos significado que no hay pérdida de fidelidad en los ácidos nucleicos transformados o aisladas. A continuación amplificada de aguas residuales crudas de pinchos (calle D) o ácidos nucleicos aislados de las aguas residuales de pinchos (calles E y F). Estos datos indican que los ácidos nucleicos aislados como resultado una mayor amplificación frente a los ácidos nucleicos no aisladas a partir de muestras de aguas residuales con púas. Por consiguiente, concluimos que, o bien inhibidores de la PCR se encuentran naturalmente en las aguas residuales fueron eliminados en forma aislada o que los ácidos nucleicos se concentraron en el aislamiento. Una combinación de estas dos hipótesis es también posible. Espectroscopia ultravioleta se utilizó junto a mostrar que los ácidos nucleicos aislados eran relativamente libre of proteína contaminante. Figura 3 muestra los espectros UV de dos E. coli O157: H7 extracciones de ácidos nucleicos, el aislamiento denominados A y B de aislamiento, en comparación con el espectro normalizado del cultivo bacteriano, etiquetado de pre-aislamiento. Los espectros UV de los ácidos nucleicos aislados se asemeja a los espectros de puros ácidos nucleicos, que tiene una relación calculada de absorbancia entre 260 nm y 280 nm se aproximan 1,8 10. Estos datos muestran que hay muy poca proteína contaminante en la fracción de ácido nucleico recuperado utilizando la técnica descrita. Aislamiento de proteínas: proteína recuperada a partir del experimento de aislamiento de ácidos nucleicos / proteína es inmunorreactiva y electroforéticamente idéntica a la proteína pura. Ejemplo 2: La fracción de proteína aislada se aplicó a la E. RapidChek coli O157 tiras laterales de flujo de ensayo (SDIX, Inc.). Los controles muestran una identificación positiva en todas las muestras que albergan E. E. O157, con o sin inducción STX (Figura 4, los carriles B y C, respectivamente). Los datos de la Figura 4 se muestran los resultados positivos de las muestras que albergan E. coli O157 que se procesaron para los ácidos nucleicos y proteínas a continuación, utilizando la pipeta de extracción. Estos datos muestran que la proteína aislada de cada muestra es inmunorreactiva desencadenando así una respuesta positiva. Amplificación por PCR (como se describe en el Ejemplo 1) se realizó en las muestras de proteína para demostrar que la fracción de proteína aislada carecía de contaminar los ácidos nucleicos. Los resultados de estos experimentos fueron negativos por electroforesis en gel. Por lo tanto, se concluye que el contenido en proteínas de la muestra se separó de la contaminación de los ácidos nucleicos. Estos resultados, tomada en conjunto con los descritos para la demostración paso de ácido nucleico de aislamiento que los ácidos nucleicos y proteínas están aisladas en etapas de fraccionamiento separadas. t "> Ejemplo 3:. La proteína aislada es adecuada para electroforesis 10 Figura 5 representa un teñido con Coomassie 8% en gel de acrilamida cargado con BSA (Figura 5, carriles A y C) y BSA aislado de isotiocianato de guanidina 6M utilizando la extracción pipeta y asociado protocolo. La movilidad electroforética de la proteína aislada es idéntica a la de las muestras de control. Por lo tanto la conclusión de que el proceso de extracción no altera la estructura covalente de la proteína aislada. Figura 1, Panel A: Representación de un típico procedimiento de extracción de ácidos nucleicos La muestra se mezcla con tiocianato de guanidina 6M en el tubo de muestra y se pasa sobre el sorbente cinco veces.. Después de que el último paso, la muestra se añadió al tampón de extracción de proteínas. Los ácidos nucleicos y la envolvente sorbentes se lavan dos veces con etanol. La muestra es entonces aire dried y se eluyó desde el sorbente. Figura 1, Panel B: Representación de un procedimiento de extracción de proteínas típica La muestra se mezcla con tampón proteína aislada de la etapa 1, la Figura 1, el panel A se pasa sobre el sorbente de una pipeta segunda extracción 15 veces.. El resto del procedimiento es idéntico al del protocolo de extracción de ácido nucleico. Figura 2:. Imagen negativa de un bromuro de etidio en gel de agarosa teñido Un multiplexado Shiga gen de la toxina 1 y 2 experimento de amplificación se realizó utilizando muestras de cultivo (carriles A y B) o muestras de aguas residuales crudas enriquecidas con E. coli O157: H7 (calles D, E y F). Las muestras se añadió directamente a un tubo de reacción de PCR (carriles A y D) o las muestras fueron procesadas utilizando el proces aislamientos y los ácidos nucleicos extraídos se añadieron al tubo de reacción de PCR (muestras B, E y F). El protocolo de PCR es una modificación del descrito por Feng et al 11. Nuestra modificación dirigida sólo a los amplificada por el stx 1 (banda inferior) y stx 2 (banda superior) pares de iniciadores, la deserción todas las parejas de cebadores otros. Carril C es la escalera 1Kb de BioRad. Figura 3: Resultados de la espectroscopia UV de E. coli O157: H7 ácidos nucleicos aislados utilizando la pipeta extracción informó Los ácidos nucleicos aislados están etiquetados aislamiento ayb aislamiento.. El espectro UV de la muestra se ensayó también antes de la extracción de ácidos nucleicos y la etiqueta es de pre-aislamiento. Los espectros se obtuvieron utilizando un espectrofotómetro Hitachi U3010 y el paquete de software asociado. <br/> Figura 4:. Foto color de las tiras de prueba RapidChek El contenido de proteína de las muestras utilizadas en la Figura 2 se aisló utilizando la pipeta de extracción y se ensayaron para la inmuno-reactividad mediante el ensayo de flujo lateral. Los carriles de CA son los controles sin procesar, es decir, se añadió el cultivo de células de la tira de prueba sin ácido nucleico o la extracción de proteínas. Línea A es E. coli BL21 DE3 pLysS como un control negativo, carriles B y C muestran E. coli O157: H7 que no fue tratada (B), o tratados con mitomicina C durante 4 horas (C). Los carriles D a H muestran los resultados de la adición de la proteína extraída de las tiras de prueba de flujo lateral. Los carriles D y E se probaron utilizando extracto de proteína de E. coli BL21 DE3 pLysS ya sea sin (D) o con mitomicina C tratamiento (E) como controles negativos. Los carriles AFP presentan los resultados cuando se extrae la proteína de E. coli O157: H7 fue utilizado. La proteína se extrae de no tratada (F), o de 2 horas (G) o 4 horas (H) mitomicina C cultivos tratados.Los resultados positivos producen una línea doble de color rojo. Figura 5:. Fotografía de un teñido con Coomassie de SDS-PAGE de BSA se aisló de la solución con la pipeta extracción y protocolos descritos. Los carriles A y C son los carriles de control de 250 mg / ml y 500 mg / ml, respectivamente. Los carriles B y D representan BSA recuperado a partir de soluciones que contienen las mismas concentraciones que sus respectivos controles.