Electricidade-Free, Ácido Nucleico seqüencial e isolamento de proteínas

Isolamento de ácido nucleico: ácidos nucleicos isolados são PCR amplificável e livre de contaminação de proteína. Exemplo 1: Os ácidos nucleicos recuperados são adequados para utilização na PCR aplicações baseadas. Por exemplo, a Figura 2 mostra a amplificação de genes associados a toxina Shiga entero E. coli O157: H7 estirpe EDL-933 (ATCC # 35150) de um procedimento de extracção de ácido nucleico / proteína utilizando a pipeta de extracção. Os genes toxina Shiga stx 1 e stx 2 são encontrados em bacteriófago lambda do tipo temperado e com defeito bacteriófago nesta e em outras entero E. coli sob o controlo do promotor P R 5 6 7 8. A ativação da resposta SOS em E. coli leva a profago indução e / ou a produção de toxina 9. Nós utilizada uma versão modificada do ensaio de PCR multiplexado por Feng et ai. 11 para identificar a stx 1 e stx 2 genes, tanto em cultura e as amostras de esgoto perfurantes. As pistas A e B na Figura 2 mostram os resultados de uma amplificação por PCR de uma amostra de cultura não transformadas (pista A) e uma amostra de cultura processado (pista B). Estes resultados são significado praticamente idêntico, não há perda de fidelidade nos ácidos nucleicos transformados ou isolado. A seguir, amplificado esgoto enriquecido (pista D) ou ácidos nucleicos isolados de esgoto enriquecido (pistas E & F). Estes dados indicam que os ácidos nucleicos isolados resultou em maior amplificação versus os ácidos nucleicos não isoladas a partir de amostras de esgoto perfurantes. Concluímos, portanto, que os inibidores de PCR quer naturalmente encontrados no esgoto foram removidos no isolamento ou que os ácidos nucleicos foram concentrados no isolamento. Uma combinação destas duas hipóteses é também possível. Espectroscopia de ultravioleta foi próxima usado para mostrar que os ácidos nucleicos isolados eram relativamente livre oproteína f contaminante. A Figura 3 mostra os espectros de UV de dois E. isolamento de ácido nucleico H7 extracções, rotulados e um b isolamento, em comparação com o espectro normalizado da cultura bacteriana, rotulada isolamento do pré-: coli O157. Os espectros de UV dos ácidos nucleicos isolados semelhante à espectros de puras ácidos nucleicos, tendo uma proporção calculada de absorvância entre 260 nm e 280 nm que se aproximam 1,8 10. Estes dados mostram que há muito pouca proteína contaminante na fracção de ácido nucleico recuperado utilizando a técnica descrita. Isolamento da proteína: proteína recuperado a partir da experiência de isolamento de ácido nucleico / proteína é imunorreactivo e electroforeticamente idêntica à proteína pura. Exemplo 2: A fracção de proteína isolada foi aplicada ao E. RapidChek coli O157 tiras de fluxo lateral de ensaio (SDIX, Inc.). Controles de mostrar uma identificação positiva em todas as amostras que abrigam E. coli O157, com ou sem STX indução (Figura 4, pistas B e C, respectivamente). Os dados na Figura 4 também mostram resultados positivos para as amostras que albergam E. coli O157 que foram processados ​​para ácidos nucleicos e então a proteína utilizando a pipeta de extracção. Estes dados mostram que a proteína isolada a partir de cada amostra é imunoreactivo desencadeando assim uma resposta positiva. A amplificação por PCR (como descrito no Exemplo 1) foi realizada sobre as amostras de proteína para mostrar que a fracção de proteína isolada era desprovido de contaminantes ácidos nucleicos. Os resultados para estes experimentos foram todos negativos por eletroforese em gel. Assim, conclui-se que o teor de proteína da amostra foi separada a partir de ácidos nucleicos contaminantes. Estes resultados, tomada em conjunto com as descritas para o passo de ácido nucleico mostram que o isolamento dos ácidos nucleicos e teor de proteína são isolados em passos de fraccionamento separadas. t "> Exemplo 3:. A proteína isolada é adequado para electroforese 10 A Figura 5 representa uma coomassie coradas gel de acrilamida a 8% carregado com BSA (Figura 5, pistas A e C) e BSA isolado a partir de 6M isotiocianato de guanidina utilizando a extracção pipeta e associado protocolo. A mobilidade electroforética da proteína isolada é idêntica à das amostras de controlo. Concluímos daí que o processo de extracção não altera a estrutura covalente da proteína isolada. Figura 1, Painel A: Representação de um procedimento de extracção de ácido nucleico típico A amostra é misturada com tiocianato de guanidina 6M no tubo de amostra e passada ao longo dos sorventes cinco vezes.. Após a última passagem, a amostra é adicionada ao tampão de extracção de proteínas. Os ácidos nucleicos sorventes e acoplado são lavadas duas vezes com etanol. A amostra é então ar dRied e eluiu-se a partir do adsorvente. A Figura 1, Painel B: Representação de um procedimento típico da proteína de extracção A amostra misturada com tampão de isolamento de proteínas a partir do passo 1, a Figura 1, painel A é passado sobre o sorvente de uma pipeta de extracção segundo 15 vezes.. O resto do procedimento é idêntico ao do protocolo de extracção de ácido nucleico. Figura 2:. Imagem negativa de um brometo de etídio gel de agarose corado Um multiplexados toxina Shiga 1 e 2 experimento amplificação do gene foi realizada utilizando amostras de cultura (pistas A e B) ou de amostras de esgoto em bruto dopada com E. coli O157: H7 (pistas D, E e F). As amostras foram, quer directamente adicionado a um tubo de reacção de PCR (pistas A e D) ou as amostras foram processadas utilizando o proces isolamentos, e os ácidos nucleicos extraídos foram adicionados ao tubo de reacção de PCR (Amostras B, E e F). O protocolo de PCR é uma modificação do descrito por Feng et al 11. Nossa modificação alvo apenas aqueles amplificado pelo stx 1 (banda inferior) e stx 2 (banda superior) pares de primers, abandono todos os pares de primers outros. Pista C é a escada 1Kb da BioRad. Figura 3: Os resultados de espectroscopia de UV de E. coli O157: H7 ácidos nucleicos isolados utilizando a pipeta de extracção relatado Os ácidos nucleicos isolados são rotulados isolamento e uma b isolamento.. O espectro de UV da amostra foi também testada antes da extracção de ácido nucleico e é rotulado pré-isolamento. Os espectros foram obtidos utilizando um Espectrofotómetro Hitachi U3010 e associados pacote de software. <br/> Figura 4:. Foto cor de tiras de teste RapidChek O conteúdo de proteína das amostras utilizadas na Figura 2 foi isolado utilizando a pipeta de extracção e testados para a imuno-reactividade por ensaio de fluxo lateral. Lanes AC são controlos não transformados, que é, a cultura de células foi adicionado para a tira de teste sem ácido nucleico ou de extracção de proteínas. Pista A é E. coli BL21 DE3 pLysS como um controlo negativo, Lanes B e C mostram E. coli O157: H7 que não foi tratado (B), ou tratadas com mitomicina C durante 4 horas (C). Lanes D através de H mostram os resultados da adição da proteína extraída para as tiras de teste de fluxo lateral. Lanes D e E foram sondadas utilizando o extracto de proteína a partir de E. coli BL21 DE3 pLysS, quer sem (D) ou com mitomicina C tratamento (E) como controlos negativos. Lanes FH mostrar os resultados quando extraído de proteínas de E. coli O157: H7 foi usado. A proteína foi extraída não tratado (F), ou a partir de 2 horas (G) ou 4 horas (H) da mitomicina C culturas tratadas.Os resultados positivos produzir uma linha dupla vermelha. Figura 5:. A fotografia de um corado com Coomassie SDS-PAGE BSA foi isolado a partir da solução utilizando a pipeta de extracção e protocolos descritos. As pistas A e C são faixas de controlo de 250 ug / mL e 500 ug / mL, respectivamente. Lanes B e D representam BSA recuperado a partir de soluções contendo as mesmas concentrações como os seus respectivos controlos.