Observação Direta e Mensuração Automatizada das Respostas Estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 em Arabidopsis thaliana

Estômatos são poros microscópicos cercados por um par de células de guarda na superfície das folhas e outras partes aéreas das plantas. Em ambientes em constante mudança, a regulação da abertura estomática é fundamental para que as plantas controlem a absorção de dióxido de carbono necessária para a fotossíntese às custas da perda de água via transpiração. Assim, a quantificação da abertura estomática tem sido fundamental para o entendimento da adaptação ambiental das plantas. No entanto, quantificar a abertura estomática é inerentemente demorado e complicado, pois requer trabalho humano para detectar e medir poros estomáticos em uma imagem foliar capturada por um microscópio. Para contornar essas limitações, vários métodos têm sido desenvolvidos para facilitar a quantificação da abertura estomática em Arabidopsis thaliana, uma planta-modelo extensivamente utilizada para estudar a biologia estomática1,2,3,4,5,6. Por exemplo, um porômetro pode ser usado para medir a taxa de transpiração como uma métrica de condutância estomática. Entretanto, este método não fornece informações diretas sobre o número estomático e a abertura que determinam a condutância estomática. Alguns estudos utilizaram técnicas de microscopia confocal destacando poros estomáticos utilizando um marcador fluorescente de actina, um corante fluorescente ou autofluorescência da parede celular ^1,2,3,4,5. Embora essas abordagens facilitem a detecção de estômatos, o custo de operar uma instalação de microscopia confocal e preparar amostras de microscopia pode ser um obstáculo para a aplicação de rotina. Em um trabalho pioneiro de Sai et al., um modelo de rede neural profunda foi desenvolvido para medir automaticamente a abertura estomática a partir de imagens microscópicas de campo claro de peelings epidérmicos de A. thaliana ⁶. No entanto, essa inovação não isenta os pesquisadores da tarefa de preparar um peeling epidérmico para observação microscópica. Recentemente, esse obstáculo foi superado com o desenvolvimento de um aparelho portátil de imagem capaz de observar estômatos pinçando uma folha de A. thaliana, juntamente com um pipeline de análise de imagens baseado em aprendizado profundo que mede automaticamente a abertura estomática a partir de imagens foliares capturadas pelo dispositivo⁷.

Os estômatos contribuem para a imunidade inata das plantas contra patógenos bacterianos. A chave para essa resposta imune é o fechamento estomático que restringe a entrada bacteriana através dos poros microscópicos no interior da folha, onde patógenos bacterianos proliferam e causam doenças⁸. O fechamento estomático é induzido pelo reconhecimento de padrões moleculares associados a micróbios (MAMPs), moléculas imunogênicas que são frequentemente comuns a uma classe de micróbios, por receptores de reconhecimento de padrões localizados na membrana plasmática (PRRs)⁹. Um epítopo de 22 aminoácidos da flagelina bacteriana conhecido como flg22 é um MAMP típico que induz o fechamento estomático através do seu reconhecimento pelo PRR FLS2¹⁰. Como contramedida, patógenos bacterianos como Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 (Pto) e Xanthomonas campestris pv. vesicatórios desenvolveram mecanismos de virulência para reabrir estômatos9,11,12. Essas respostas estomáticas a patógenos bacterianos têm sido convencionalmente analisadas em ensaios nos quais cascas epidérmicas foliares, discos foliares ou folhas destacadas são flutuadas em suspensão bacteriana e, em seguida, estômatos são observados ao microscópio seguido de medição manual da abertura estomática. No entanto, esses ensaios são pesados e podem não refletir as respostas estomáticas à invasão bacteriana natural que ocorre em uma folha aderida à planta.

Aqui, um método simples é apresentado para investigar o fechamento e a reabertura estomáticos durante a invasão de Pto sob a condição que mimetiza de perto a interação natural planta-bactéria. Este método utiliza o dispositivo portátil de imagem para observação direta de estômatos de A. thaliana em uma folha acoplada à planta inoculada com Pto, juntamente com a tubulação de análise de imagem para medição automatizada da abertura estomática.

1. Plantas em crescimento

1. Para quebrar a dormência, ressuspenda sementes de A. thaliana (Col-0) em água deionizada e incube-as a 4 °C por 4 dias no escuro.
2. Semeie as sementes no solo e cresça em uma câmara equipada com luz fluorescente branca. Manter as seguintes condições de crescimento: temperatura de 22 °C, intensidade luminosa de 6.000 lux (ca. 100 μmol/m²/s) por 10 h e umidade relativa de 60%.
3. Quando necessário, regue as plantas com um fertilizante líquido. Abster-se de regar de 1 semana a 2 dias antes da inoculação e regar bem 1 dia antes da inoculação.

2. Preparação do inóculo bacteriano

1. Streak Pto do estoque de glicerol em meio King's B (KB) solidificado (20 g de triptona, 1,5 g de K₂HPO₄ e 15 g de glicerol para 1 L, ágar 1,5%) com 50 μg/mL de rifampicina e incubar a 28 °C por 2 dias.
2. Inocular uma única colônia a 5 mL de meio líquido KB com 50 μg/mL de rifampicina e incubar a 28 °C com agitação a 200 rpm até a fase logarítmica tardia de crescimento.
3. Centrifugar a cultura a 6.000 x g por 2 min, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 mL de água estéril. Repita esta etapa mais uma vez.
4. Retire o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão de abertura dos estômatos (25 mM MES-KOH pH 6,15, 10 mM KCl) e meça o OD₆₀₀.
5. Diluir a suspensão para OD₆₀₀ 0,2 com tampão de abertura dos estômatos contendo tensoativo de silicone a 0,04%.

3. Inoculação por pulverização de bactérias

1. A partir de 1 dia antes da inoculação até o final do experimento, expor as plantas a uma intensidade de luz de cerca de 10.000 lux (ca. 170 μmol/m²/s).
2. Para garantir que a maioria dos estômatos esteja aberta, mantenha as plantas em uma bandeja coberta com uma tampa transparente sob a luz por pelo menos 3 h antes da inoculação por pulverização.
3. Retire a tampa e use um aerógrafo para pulverizar o lado abaxial das folhas com 2,5 mL de suspensão bacteriana por três plantas em um único vaso.
4. Incubar as plantas inoculadas em uma bandeja coberta com tampa transparente para manter uma umidade relativa em torno de 85%.
5. Adquirir imagens de estômatos em 1 h e 3 h após a inoculação por pulverização usando o método descrito na seção 4.

4. Observação direta dos estômatos com o aparelho portátil de imagem

NOTA: O dispositivo portátil de imagem estomática é equipado com uma luz LED e um módulo de câmera e pode adquirir imagens de 2.592 × 1.944 (altura × largura; pixels) com uma resolução de cerca de 0,5 μm/pixel.

1. Conecte o aparelho portátil de imagem estomática a um computador pessoal (PC) equipado com software de aquisição de imagens.
2. Remova suavemente, mas completamente, as gotículas de água das folhas inoculadas com um pedaço de papel.
3. Abra a tampa superior do dispositivo, coloque a folha sobre o palco e feche a tampa superior (Figura 1).
4. Ajuste o foco da imagem manipulando o parafuso do ajustador e clique no botão Salvar imagem na tela do PC. A imagem será adquirida instantaneamente. Normalmente, uma imagem focalizada contém aproximadamente 10 estômatos analisáveis. Para obter resultados robustos, adquira imagens estomáticas de seis folhas de três plantas diferentes (duas folhas por planta).

5. Medição manual da abertura estomática

NOTA: O software ImageJ pode ser baixado em https://imagej.nih.gov/ij/download.html

1. Abra um arquivo de imagem no ImageJ.
2. Abra o gerenciador de ROI selecionando Analisar ferramentas > > Gerenciador de ROI.
3. Use a ferramenta de seleção de linha reta para desenhar uma linha correspondente à largura de um estoma (Figura 2) e registre o ROI clicando em Adicionar no Gerenciador de ROI.
4. Traçar uma linha correspondente ao comprimento do mesmo estoma (Figura 2A) e registrar a ROI conforme descrito no passo 5.3.
5. Clique em Medir no Gerenciador de ROI para medir a largura e o comprimento.
6. Divida a largura pelo comprimento para obter a abertura estomática (razão). Para uma quantificação robusta, utilizar 60 ou mais estômatos para cada tratamento e momento. Não escolher estômatos prematuros ou obscuros para a análise (Figura 2B, C).

6. Medição automatizada da abertura estomática

NOTA: O pipeline de análise de imagens é executado no Google Colaboratory, um ambiente executável da linguagem de programação Python na nuvem. Os usuários devem ter uma conta do Google válida com um Google Drive funcional, navegador Google Chrome e uma conexão estável com a Internet como pré-requisito.

1. Faça o download do bloco de anotações Google Colaboratory de Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) e abra o bloco de anotações.
2. Faça uma cópia local do bloco de anotações no Google Drive selecionando Arquivo > Salvar uma cópia no Drive. Depois que uma nova guia for exibida, feche com segurança a guia do bloco de anotações original.
3. Pressione o botão Executar uma vez abaixo da seção Configuração ambiental no bloco de anotações sem desdobrar os blocos de células para importar as bibliotecas necessárias.
4. Execute a seção Configurações do diretório para criar três pastas usadas para análise (por exemplo, example_result, inference_results e modelo) no Google Drive.
   Observação : nesse caso, as pastas chamadas example_result, inference_results e modelo são usadas como o diretório parental, armazenando resultados de inferência e modelos treinados, respectivamente. Este bloco de anotações mostra um exemplo de construção de diretório como um procedimento representativo. Para alterar o nome, reescreva o caminho pardir, infdir ou modeldir .
5. De acordo com a seção Preparação das Imagens , mova as imagens adquiridas para example_result, agrupadas em títulos de imagem por tratamento ou amostra (por exemplo, mock_1h_XXXXXX.jpg) para a geração final do gráfico. Imagens de amostra estão disponíveis em Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528).
6. Execute a parte Download Trained Models para baixar os arquivos ONNX dos modelos treinados do Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) e coloque-os sob o diretório do modelo .
7. Execute a parte de Inferência e Medição da Abertura Estomática para quantificar a abertura estomática a partir de imagens individuais. As imagens de resultado com inferência sobreposta e o arquivo csv chamado example_result.csv serão exportados para o diretório inference_results.
8. Execute a seção Geração de Gráfico para criar um gráfico sobre a razão de abertura estomática, exportada para o diretório inference_results .

Após a inoculação por atomização do Pto, estômatos nas folhas aderidas às plantas inoculadas foram observados diretamente pelo aparelho portátil de imagem estomática. Usando medidas manuais e automatizadas, as mesmas imagens foliares foram usadas para calcular a abertura estomática, considerando razões entre largura e comprimento de aproximadamente 60 estômatos. Medidas manuais e automatizadas indicaram consistentemente uma diminuição na abertura estomática em plantas inoculadas com Pto em comparação com plantas inoculadas em simulações 1 hora após a inoculação (hpi) (Figura 3A,B), indicando que plantas de A thaliana fecham estômatos em resposta à invasão de Pto. Aos 3 hpi, a abertura estomática nas plantas inoculadas com Pto e nas plantas inoculadas simuladas foi praticamente a mesma (Figura 3C,D), lembrando a reabertura estomática pelo Top. Notavelmente, a medida automatizada da abertura estomática levou apenas aproximadamente 5 s para processar uma imagem (Tabela 1), reduzindo o tempo de medição em mais de 95% em comparação com a medida manual. Assim, este protocolo oferece um meio operacionalmente simples e trabalhoso para rastrear as respostas estomáticas dinâmicas de A. thaliana ao patógeno bacteriano.

Figura 1: Dispositivo de imagem portátil. Imagens representando o dispositivo portátil de imagem com uma folha colocada no palco (esquerda) e com a tampa superior fechada (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Diagrama esquemático da medida da abertura estomática. (A) A abertura estomática é determinada calculando-se a razão entre largura e comprimento de um estoma, indicada pelas setas brancas. (B) Estômatos prematuros e (C) obscuros devem ser excluídos da medição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Respostas estomáticas ao Pto em planta íntegra intacta. Plantas de A. thaliana foram inoculadas por aspersão ou Pto, e estômatos nas folhas aderidas às plantas inoculadas foram observados diretamente em (A,B) 1 hpi e (C,D) 3 hpi pelo aparelho portátil de imagem estomática. A abertura (razão) estomática foi calculada por medidas manuais (A,C) e (B,D) automatizadas. Os valores de p foram calculados pelo teste t bicaudal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Tempo de processamento das medidas manuais e automatizadas da abertura estomática por imagem. Médias e desvios-padrão (DP) do tempo de processamento foram calculados a partir das medidas de nove imagens representativas.

Estudos prévios utilizaram cascas epidérmicas, discos foliares ou folhas destacadas para investigar respostas estomáticas a invasões bacterianas ^9,11,12. Em contrapartida, o método proposto neste estudo utiliza o aparelho portátil de imagem estomática para observar diretamente estômatos em uma folha aderida à planta após inoculação por atomização por atomização, mimetizando condições naturais de invasão bacteriana. Além disso, como esse método não envolve processos destrutivos de preparação de amostras, como desprendimento foliar, excisão de discos foliares e descamação epidérmica, pode-se evitar feridas e perdas de água associadas a esses processos de preparo de amostras. Esses efeitos não devem ser tomados de ânimo leve, pois ferimento e perda de água inevitavelmente produzem sinais derivados de plantas, como os fitohormônios jasmonato e ácido abscísico, que afetam os movimentos estomáticos^13,14.

Existem várias diretrizes para o uso ideal do aparelho portátil de imagem estomática. Em primeiro lugar, remover completamente as gotículas de água das superfícies das folhas é fundamental para obter imagens de clareza e foco ideais. Em segundo lugar, recomenda-se tirar várias imagens de áreas foliares idênticas manipulando o parafuso do ajustador para ajustar o foco. Espera-se que essa prática aumente o número de estômatos analisáveis por área foliar, mitigando potenciais vieses de amostragem. Por fim, ao beliscar uma folha com o dispositivo, é necessário um manuseio cuidadoso para evitar causar danos à folha. Isso é fundamental, pois a lesão é uma das pistas que provocam o fechamento estomático¹⁴.

A abertura estomática tendeu a ser mais variável na medida automática do que na medida manual (Figura 3). Há várias razões possíveis para isso. Foi relatado anteriormente que os poros estomáticos inferidos pelo pipeline de análise de imagens frequentemente incluem paredes celulares e/ou sombras de células-guarda ao redor do poro estomático⁷, o que não é o caso na medição manual por olhos humanos. Estomas com formas incomuns também podem afetar a variação entre medidas manuais e automatizadas, embora o modelo de detecção de estômatos tenha sido treinado para excluir tais estômatos da^análise7. Alguns estômatos receberam valores zero para abertura estomática na medida automática, mas nenhum na medida manual por razões desconhecidas. Atualizações futuras dos modelos podem ser necessárias para resolver esses problemas. No entanto, como a medida automatizada da abertura estomática correspondia essencialmente à medição manual, a versão atual do pipeline de análise de imagens é de uso prático.

A observação direta e a medida automatizada da abertura estomática em A. thaliana descritas neste estudo são promissoras para várias aplicações na elucidação do papel dos estômatos na adaptação ambiental das plantas. Por exemplo, o método apresentado deve ser amplamente aplicável para quantificar rapidamente a abertura estomática em um sistema vegetal inteiro intacto após exposição a estresses bióticos como MAMPs e patógenos microbianos, bem como estresses abióticos como seca. Em apoio a isso, um estudo anterior aplicou com sucesso o pipeline de análise de imagens para quantificar com precisão a abertura estomática de "discos foliares" tratados com a toxina fúngica fusicocina que induz a abertura estomática ou com o hormônio do estresse ácido abscísico que induz o fechamento estomático⁷. Além disso, em princípio, o dispositivo de imagem portátil permite a análise de longo prazo da abertura estomática em uma única folha idêntica aderida à planta. Isso pode lançar luz sobre novos aspectos das interações planta-micróbio, pois a maioria dos estudos tem se concentrado nas respostas estomáticas a patógenos bacterianos nas primeiras horas da interação ^9,10,11. Também será interessante empregar e modificar o método apresentado para explorar as respostas estomáticas à invasão bacteriana sob diversas condições ambientais. Isso é particularmente relevante para a compreensão dos impactos de fatores ambientais, como temperatura, umidade e disponibilidade de água no solo, que afetam os movimentos estomáticos e o desenvolvimento de doenças por patógenos bacterianos ^8,15. Em conclusão, o método apresentado será vislumbrado para acelerar a pesquisa sobre as funções estomáticas dentro e além das interações planta-micróbio sob cenários experimentais até então inatingíveis.