Direkte observasjon og automatisert måling av stomatal respons på Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000 i Arabidopsis thaliana

Stomata er mikroskopiske porer omgitt av et par vaktceller på overflaten av blader og andre luftdeler av planter. Under stadig skiftende miljøer er regulering av stomatalåpningen sentral for planter å kontrollere karbondioksidopptaket som kreves for fotosyntese på bekostning av vanntap via transpirasjon. Dermed har kvantifisering av stomatal blenderåpning vært medvirkende til å forstå plantens miljøtilpasning. Imidlertid er kvantifisering av stomatal blenderåpning iboende tidkrevende og tungvint, da det krever menneskelig arbeidskraft å oppdage og måle stomatale porer i et bladbilde fanget av et mikroskop. For å omgå disse begrensningene har ulike metoder blitt utviklet for å lette kvantifiseringen av stomatal blenderåpning i Arabidopsis thaliana, en modellplante som i stor grad brukes til å studere stomatal biologi ^1,2,3,4,5,6. For eksempel kan et porometer brukes til å måle transpirasjonshastighet som en metrisk av stomatal konduktans. Denne metoden gir imidlertid ikke direkte informasjon om stomatalnummer og blenderåpning som bestemmer stomatal konduktans. Noen studier har brukt konfokale mikroskopiteknikker som fremhever stomatale porer ved hjelp av en fluorescerende aktinmarkør, et fluorescerende fargestoff eller celleveggautofluorescens 1,2,3,4,5. Selv om disse tilnærmingene letter påvisning av stomata, kan kostnadene ved både drift av et konfokalmikroskopianlegg og utarbeidelse av mikroskopiprøver være et hinder for rutinemessig anvendelse. I et banebrytende arbeid av Sai et al. ble det utviklet en dyp nevral nettverksmodell for automatisk å måle stomatal blenderåpning fra lysfeltmikroskopiske bilder av A. thaliana epidermal peeling⁶. Likevel fritar denne innovasjonen ikke forskere fra oppgaven med å forberede en epidermal peeling for mikroskopisk observasjon. Nylig ble denne hindringen overvunnet ved å utvikle en bærbar bildebehandlingsenhet som kan observere stomata ved å klemme et blad av A. thaliana, sammen med en dyplæringsbasert bildeanalyserørledning som automatisk måler stomatal blenderåpning fra bladbilder tatt av enheten⁷.

Stomata bidrar til plantemedfødt immunitet mot bakterielle patogener. Nøkkelen til denne immunresponsen er stomatal lukning som begrenser bakteriell inngang gjennom den mikroskopiske poren inn i bladets indre, hvor bakterielle patogener sprer seg og forårsaker sykdommer⁸. Stomatal lukning induseres ved anerkjennelse av mikrobeassosierte molekylære mønstre (MAMPs), immunogene molekyler som ofte er felles for en klasse mikrober, av plasmamembranlokaliserte mønstergjenkjenningsreseptorer (PRR)⁹. En 22 aminosyre epitop av bakteriell flagellin kjent som flg22 er en typisk MAMP som induserer stomatal lukning gjennom anerkjennelse av PRR FLS2¹⁰. Som et mottiltak, bakterielle patogener som Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000 (Pto) og Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria har utviklet virulensmekanismer for å gjenåpne stomata ^9,11,12. Disse stomatale responsene på bakterielle patogener har blitt konvensjonelt analysert i analyser der enten bladepidermale peelinger, bladskiver eller frittliggende blader flyter på bakteriell suspensjon, og deretter observeres stomata under et mikroskop etterfulgt av manuell måling av stomatal blenderåpning. Imidlertid er disse analysene tungvint og kan ikke gjenspeile stomatale responser på naturlig bakteriell invasjon som oppstår i et blad festet til planten.

Her presenteres en enkel metode for å undersøke stomatal lukking og gjenåpning under Pto-invasjonen under den betingelsen som etterligner den naturlige plante-bakterie-interaksjonen. Denne metoden utnytter den bærbare bildebehandlingsenheten for direkte observasjon av A. thaliana stomata på et blad festet til planten inokulert med Pto, sammen med bildeanalyserørledningen for automatisert måling av stomatal blenderåpning.