Direkt observation och automatiserad mätning av klyvöppningar på Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000 i Arabidopsis thaliana

Klyvöppningar är mikroskopiska porer omgivna av ett par skyddsceller på ytan av blad och andra luftiga delar av växter. I ständigt föränderliga miljöer är reglering av klyvöppningarna central för att växter ska kunna kontrollera det koldioxidupptag som krävs för fotosyntesen på bekostnad av vattenförlust via transpiration. Kvantifiering av klyvöppningen har därför varit avgörande för att förstå växternas miljöanpassning. Att kvantifiera klyvöppningen är dock i sig tidskrävande och besvärligt eftersom det kräver mänskligt arbete för att upptäcka och mäta klyvöppningarnas porer i en bladbild som fångats av ett mikroskop. För att kringgå dessa begränsningar har olika metoder utvecklats för att underlätta kvantifieringen av klyvöppningar i Arabidopsis thaliana, en modellväxt som i stor utsträckning används för att studera klyvöppningarnas biologi 1,2,3,4,5,6. Till exempel kan en porometer användas för att mäta transpirationshastigheten som ett mått på klyvöppningarnas konduktans. Denna metod ger dock ingen direkt information om klyvöppningarnas antal och bländare som bestämmer klyvöppningarnas konduktans. Vissa studier har använt konfokalmikroskopitekniker som belyser klyvöppningar med hjälp av en fluorescerande aktinmarkör, ett fluorescerande färgämne eller cellväggsautofluorescens 1,2,3,4,5. Även om dessa metoder underlättar detektion av klyvöppningar, kan kostnaden för att både driva en konfokalmikroskopianläggning och förbereda mikroskopiprover vara ett hinder för rutinmässig tillämpning. I ett banbrytande arbete av Sai et al. utvecklades en modell för djupa neurala nätverk för att automatiskt mäta klyvöppningar från ljusfältsmikroskopiska bilder av A. thaliana epidermal peeling⁶. Ändå befriar denna innovation inte forskare från uppgiften att förbereda en epidermal peeling för mikroskopisk observation. Nyligen övervanns detta hinder genom att utveckla en bärbar bildenhet som kan observera klyvöppningar genom att nypa ett blad av A. thaliana, tillsammans med en djupinlärningsbaserad bildanalyspipeline som automatiskt mäter klyvöppningar från bladbilder som tagits av enheten⁷.

Klyvöppningar bidrar till växtens medfödda immunitet mot bakteriella patogener. Nyckeln till detta immunsvar är klyvöppningar som begränsar bakteriens inträde genom den mikroskopiska poren in i bladets inre, där bakteriella patogener förökar sig och orsakar sjukdomar⁸. Klyvöppningar induceras vid igenkänning av mikrobassocierade molekylära mönster (MAMP), immunogena molekyler som ofta är gemensamma för en klass av mikrober, av plasmamembranlokaliserade mönsterigenkänningsreceptorer (PRR)⁹. En epitop med 22 aminosyror av bakterieflagellin som kallas flg22 är en typisk MAMP som inducerar klyvöppningar genom att den känns igen av PRR FLS2¹⁰. Som en motåtgärd, bakteriella patogener som Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000 (PTO) och Xanthomonas campestris pv. Vesitoria har utvecklat virulensmekanismer för att öppna klyvöppningar ^9,11,12. Dessa klyvöppningar mot bakteriella patogener har konventionellt analyserats i analyser där antingen bladepidermal peeling, bladskivor eller lossnade blad flyter på bakteriell suspension, och sedan observeras klyvöppningar under ett mikroskop följt av manuell mätning av klyvöppningen. Dessa analyser är dock besvärliga och kanske inte återspeglar klyvöppningar på naturlig bakterieinvasion som uppstår i ett blad som är fäst vid växten.

Här presenteras en enkel metod för att undersöka klyvöppningar och återöppningar under PTO-invasion under förhållanden som nära efterliknar den naturliga interaktionen mellan växter och bakterier. Denna metod utnyttjar den bärbara avbildningsenheten för direkt observation av A. thaliana klyvöppningar på ett blad som är fäst vid växten inokulerad med PTO, tillsammans med bildanalyspipelinen för automatiserad mätning av klyvöppningar.