स्यूडोमोनास सिरिंज पीवी के लिए स्टोमेटाल प्रतिक्रियाओं का प्रत्यक्ष अवलोकन और स्वचालित मापन। टमाटर DC3000 Arabidopsis thaliana में
Summary
यहां, हम अरबिडोप्सिस थालियाना में जीवाणु आक्रमण के लिए स्टोमेटाल प्रतिक्रियाओं के प्रत्यक्ष अवलोकन और स्वचालित माप के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं। यह विधि एक पोर्टेबल स्टोमेटा इमेजिंग डिवाइस का लाभ उठाती है, साथ में डिवाइस द्वारा कैप्चर की गई पत्ती छवियों के लिए डिज़ाइन की गई छवि विश्लेषण पाइपलाइन के साथ।
Abstract
स्टोमेटा सूक्ष्म छिद्र होते हैं जो पौधे की पत्ती एपिडर्मिस में पाए जाते हैं। स्टोमेटा एपर्चर का विनियमन न केवल प्रकाश संश्लेषण और वाष्पोत्सर्जन पानी के नुकसान के लिए कार्बन डाइऑक्साइड तेज को संतुलित करने के लिए बल्कि बैक्टीरिया के आक्रमण को प्रतिबंधित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। जबकि पौधे रोगाणुओं की पहचान पर रंध्र को बंद कर देते हैं, रोगजनक बैक्टीरिया, जैसे कि स्यूडोमोनास सिरिंज पीवी। टमाटर DC3000 (Pto), पत्ती के इंटीरियर में पहुंच प्राप्त करने के लिए बंद रंध्र को फिर से खोलें। बैक्टीरियल आक्रमण के लिए स्टोमेटाल प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए पारंपरिक assays में, पत्ती एपिडर्मल peels, पत्ती डिस्क, या अलग पत्तियों बैक्टीरियल निलंबन पर तैरता रहे हैं, और फिर रंध्र एक खुर्दबीन के नीचे stomatal एपर्चर के मैनुअल माप के बाद मनाया जाता है. हालांकि, ये परख बोझिल हैं और पौधे से जुड़ी पत्ती में प्राकृतिक जीवाणु आक्रमण के लिए स्टोमेटा प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। हाल ही में, एक पोर्टेबल इमेजिंग डिवाइस विकसित किया गया था जो पौधे से अलग किए बिना एक पत्ती को पिंच करके रंध्र का निरीक्षण कर सकता है, साथ में एक गहरी सीखने-आधारित छवि विश्लेषण पाइपलाइन के साथ डिवाइस द्वारा कैप्चर की गई पत्ती छवियों से स्टोमेटा एपर्चर को स्वचालित रूप से मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यहां, इन तकनीकी प्रगति पर निर्माण, अरबिडोप्सिस थालियाना में बैक्टीरिया के आक्रमण के लिए स्टोमेटाल प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए एक नई विधि पेश की गई है। इस विधि में तीन सरल चरण होते हैं: प्राकृतिक संक्रमण प्रक्रियाओं की नकल करने वाले पीटीओ का स्प्रे इनोक्यूलेशन, पोर्टेबल इमेजिंग डिवाइस का उपयोग करके पीटीओ-इनोक्यूलेटेड प्लांट के एक पत्ते पर रंध्र का प्रत्यक्ष अवलोकन, और छवि विश्लेषण पाइपलाइन द्वारा स्टोमेटा एपर्चर का स्वचालित माप। इस पद्धति का उपयोग सफलतापूर्वक प्राकृतिक पौधे-बैक्टीरिया बातचीत की बारीकी से नकल करने वाली परिस्थितियों में पीटीओ आक्रमण के दौरान स्टोमेटाल बंद करने और फिर से खोलने के लिए किया गया था।
Introduction
स्टोमेटा सूक्ष्म छिद्र होते हैं जो पत्तियों की सतह और पौधों के अन्य हवाई भागों पर गार्ड कोशिकाओं की एक जोड़ी से घिरे होते हैं। कभी-बदलते परिवेश के तहत, वाष्पोत्सर्जन के माध्यम से पानी के नुकसान की कीमत पर प्रकाश संश्लेषण के लिए आवश्यक कार्बन डाइऑक्साइड तेज को नियंत्रित करने के लिए पौधों के लिए स्टोमेटाल एपर्चर का विनियमन केंद्रीय है। इस प्रकार, स्टोमेटा एपर्चर का परिमाणीकरण पौधे के पर्यावरण अनुकूलन को समझने के लिए महत्वपूर्ण रहा है। हालांकि, स्टोमेटा एपर्चर की मात्रा निर्धारित करना स्वाभाविक रूप से समय लेने वाली और बोझिल है क्योंकि माइक्रोस्कोप द्वारा कैप्चर की गई पत्ती की छवि में स्टोमेटा छिद्रों को स्पॉट करने और मापने के लिए मानव श्रम की आवश्यकता होती है। इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, Arabidopsis Thaaliana में stomatal एपर्चर की मात्रा का ठहराव की सुविधा के लिए विभिन्न तरीकों का विकास किया गया है, एक मॉडल संयंत्र बड़े पैमाने पर stomatal जीव विज्ञान 1,2,3,4,5,6 का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया. उदाहरण के लिए, एक पोरोमीटर का उपयोग वाष्पोत्सर्जन दर को मापने के लिए स्टोमेटा चालकता के मीट्रिक के रूप में किया जा सकता है। हालांकि, यह विधि स्टोमेटा संख्या और एपर्चर पर प्रत्यक्ष जानकारी प्रदान नहीं करती है जो स्टोमेटा चालकता निर्धारित करती है। कुछ अध्ययनों ने फ्लोरोसेंट एक्टिन मार्कर, एक फ्लोरोसेंट डाई, या सेल दीवार ऑटोफ्लोरेसेंस 1,2,3,4,5का उपयोग करके स्टोमेटाल छिद्रों को उजागर करने वाली कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग किया है। जबकि ये दृष्टिकोण रंध्र का पता लगाने की सुविधा प्रदान करते हैं, दोनों की लागत एक फोकल माइक्रोस्कोपी सुविधा के संचालन और माइक्रोस्कोपी नमूने तैयार करने के लिए नियमित आवेदन के लिए एक बाधा हो सकती है। साई एट अल द्वारा एक जमीन तोड़ने काम में, एक गहरी तंत्रिका नेटवर्क मॉडल स्वचालित रूप से ए thaliana एपिडर्मल peels6 के उज्ज्वल क्षेत्र सूक्ष्म छवियों से stomatal एपर्चर को मापने के लिए विकसित किया गया था. फिर भी, यह नवाचार शोधकर्ताओं को सूक्ष्म अवलोकन के लिए एपिडर्मल छील तैयार करने के कार्य से छूट नहीं देता है। हाल ही में, इस बाधा को एक पोर्टेबल इमेजिंग डिवाइस विकसित करके दूर किया गया था जो ए थालियाना के एक पत्ते को चुटकी बजाकर रंध्र का निरीक्षण कर सकता है, साथ में एक गहरी सीखने-आधारित छवि विश्लेषण पाइपलाइन के साथ जो डिवाइस7 द्वारा कैप्चर की गई पत्ती छवियों से स्टोमेटा एपर्चर को स्वचालित रूप से मापता है।
रंध्र जीवाणु रोगजनकों के खिलाफ पौधे की जन्मजात प्रतिरक्षा में योगदान करते हैं। इस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की कुंजी स्टोमेटाल क्लोजर है जो पत्ती के इंटीरियर में सूक्ष्म छिद्र के माध्यम से बैक्टीरिया के प्रवेश को प्रतिबंधित करता है, जहां जीवाणु रोगजनकों का प्रसार होता है और बीमारियों का कारणबनता है। स्टोमेटाल क्लोजर माइक्रोब से जुड़े आणविक पैटर्न (एमएएमपी), इम्युनोजेनिक अणुओं की मान्यता पर प्रेरित होता है जो अक्सर प्लाज्मा झिल्ली-स्थानीयकृत पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (पीआरआर)9द्वारा रोगाणुओं के एक वर्ग के लिए आम होते हैं। बैक्टीरियल फ्लैगेलिन का एक 22 एमिनो एसिड एपिटोप जिसे flg22 के रूप में जाना जाता है, एक विशिष्ट एमएएमपी है जो पीआरआर एफएलएस 210 द्वारा इसकी मान्यता के माध्यम से स्टोमेटाल क्लोजर को प्रेरित करता है। एक प्रतिवाद के रूप में, जीवाणु रोगजनकों जैसे स्यूडोमोनास सिरिंज पीवी। टमाटर DC3000 (Pto) और Xanthomonas campestris pv। वेसिकाटोरिया ने रंध्र 9,11,12 को फिर से खोलने के लिए विषाणु तंत्र विकसित किया है। बैक्टीरियल रोगजनकों के लिए इन रंध्र प्रतिक्रियाओं का पारंपरिक रूप से परख में विश्लेषण किया गया है जिसमें या तो पत्ती एपिडर्मल छिलके, पत्ती डिस्क, या अलग पत्तियों को बैक्टीरिया निलंबन पर तैराया जाता है, और फिर स्टोमेटा को माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जाता है, जिसके बाद स्टोमेटा एपर्चर का मैनुअल माप होता है। हालांकि, ये परख बोझिल हैं और पौधे से जुड़ी पत्ती में होने वाले प्राकृतिक जीवाणु आक्रमण के लिए स्टोमेटाल प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं।
यहां, पीटीओ आक्रमण के दौरान स्टोमेटाल बंद होने और फिर से खोलने की जांच करने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत की जाती है, जो प्राकृतिक पौधे-बैक्टीरिया की बातचीत की बारीकी से नकल करती है। यह विधि पीटीओ के साथ टीका लगाए गए पौधे से जुड़ी पत्ती पर ए. थालियाना रंध्र के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए पोर्टेबल इमेजिंग डिवाइस का लाभ उठाती है, साथ में स्टोमेटा एपर्चर के स्वचालित माप के लिए छवि विश्लेषण पाइपलाइन के साथ।
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले अध्ययनों में एपिडर्मल छिलके, पत्ती डिस्क, या अलग पत्तियों का इस्तेमाल बैक्टीरिया के आक्रमणों 9,11,12 के लिए रंध्र प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए किया गया था। इ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अनुसंधान परियोजना के सभी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं, ‘प्लांट-माइक्रोब होलोबियंट की असेंबली के माध्यम से पौधे अनुकूली लक्षणों का सह-निर्माण’, फलदायी चर्चाओं के लिए। इस काम को ट्रांसफॉर्मेटिव रिसर्च एरिया (21H05151 और 21H05149 से A.M. और 21H05152 से Y.T.) के लिए ग्रांट-इन-एड और चुनौतीपूर्ण खोजपूर्ण अनुसंधान के लिए अनुदान सहायता (22K19178 से A. M.) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
| Airbrush kits | ANEST IWATA | MX2900 | Accessory kits for SPRINT JET |
| Biotron | Nippon Medical & Chemical Instruments | LPH-411S | Plant Growth Chamber with white fluorescent light |
| Glycerol | Wako | 072-00626 | |
| Half tray | Sakata | 72000113 | A set of tray and lid |
| Hyponex | Hyponex | No catalogue number available | Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants |
| Image J | Natinal Institute of Health | Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Used for manual measurement of stomatal aperture |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | For MES-KOH |
| MES | Wako | 343-01621 | For MES-KOH |
| Portable stomatal imaging device | Phytometrics | Order at https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018. |
| Rifampicin | Wako | 185-01003 | Dissolve in DMSO |
| Silwet-L77 | Bio medical science | BMS-SL7755 | silicone surfactant used in spray inoculation |
| SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | Airbrush used for spray inoculation |
| SuperMix A | Sakata seed | 72000083 | Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil |
| Tryptone | Nakarai tesque | 35640-95 | |
| Vermiculite G20 | Nittai | No catalogue number available | Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil |
| White fluorescent light | NEC | FHF32EX-N-HX-S | Used for Biotron |
References
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