Direkte observation og automatiseret måling af stomatale responser på Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000 i Arabidopsis thaliana

Stomata er mikroskopiske porer omgivet af et par beskyttelsesceller på overfladen af blade og andre luftdele af planter. Under stadigt skiftende miljøer er regulering af stomatalåbningen central for planter for at kontrollere den kuldioxidoptagelse, der kræves til fotosyntese på bekostning af vandtab via transpiration. Således har kvantificering af stomatalåbningen været medvirkende til at forstå plantemiljøtilpasning. Imidlertid er kvantificering af stomatalåbningen i sagens natur tidskrævende og besværlig, da det kræver menneskelig arbejdskraft at få øje på og måle stomatale porer i et bladbillede taget af et mikroskop. For at omgå disse begrænsninger er der udviklet forskellige metoder til at lette kvantificeringen af stomatal blænde i Arabidopsis thaliana, en modelplante, der i vid udstrækning anvendes til at studere stomatal biologi ^1,2,3,4,5,6. For eksempel kan et porometer bruges til at måle transpirationshastighed som en måling af stomatal konduktans. Denne metode giver imidlertid ikke direkte information om stomatalnummeret og blænden, der bestemmer stomatal konduktans. Nogle undersøgelser har brugt konfokale mikroskopiteknikker, der fremhæver stomatale porer ved hjælp af en fluorescerende actinmarkør, et fluorescerende farvestof eller cellevægsautofluorescens 1,2,3,4,5. Mens disse tilgange letter påvisning af stomata, kan omkostningerne ved både drift af en konfokal mikroskopifacilitet og forberedelse af mikroskopiprøver være en hindring for rutinemæssig anvendelse. I et banebrydende arbejde af Sai et al. blev der udviklet en dyb neural netværksmodel til automatisk måling af stomatal blænde fra lysfeltmikroskopiske billeder af A. thaliana epidermale peelinger⁶. Alligevel fritager denne innovation ikke forskere fra opgaven med at forberede en epidermal skræl til mikroskopisk observation. For nylig blev denne hindring overvundet ved at udvikle en bærbar billeddannelsesenhed, der kan observere stomata ved at klemme et blad af A. thaliana sammen med en dyb læringsbaseret billedanalysepipeline, der automatisk måler stomatal blænde fra bladbilleder taget af enheden⁷.

Stomata bidrager til plantemedfødt immunitet mod bakterielle patogener. Nøglen til dette immunrespons er stomatal lukning, der begrænser bakteriel indtrængen gennem den mikroskopiske pore ind i bladets indre, hvor bakterielle patogener spredes og forårsager sygdomme⁸. Stomatal lukning induceres ved genkendelse af mikrobeassocierede molekylære mønstre (MAMP’er), immunogene molekyler, der ofte er fælles for en klasse af mikrober, af plasmamembranlokaliserede mønstergenkendelsesreceptorer (PRR’er)⁹. En 22 aminosyreepitop af bakteriel flagellin kendt som flg22 er en typisk MAMP, der inducerer stomatal lukning gennem dens genkendelse af PRR FLS2¹⁰. Som en modforanstaltning, bakterielle patogener såsom Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000 (Pto) og Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria har udviklet virulensmekanismer til at genåbne stomata ^9,11,12. Disse stomatale reaktioner på bakterielle patogener er traditionelt analyseret i assays, hvor enten bladepidermale skræl, bladskiver eller løsrevne blade flyder på bakteriel suspension, og derefter observeres stomata under et mikroskop efterfulgt af manuel måling af stomatal blænde. Disse analyser er imidlertid besværlige og afspejler muligvis ikke stomatale reaktioner på naturlig bakteriel invasion, der forekommer i et blad, der er fastgjort til planten.

Her præsenteres en simpel metode til at undersøge stomatal lukning og genåbning under Pto-invasion under forudsætning af, at den nøje efterligner den naturlige interaktion mellem plante og bakterier. Denne metode udnytter den bærbare billeddannelsesenhed til direkte observation af A. thaliana stomata på et blad, der er fastgjort til planten podet med Pto, sammen med billedanalyserørledningen til automatiseret måling af stomatal blænde.