Dit protocol beschrijft een efficiënte en goedkope methode die vloeibare media gebruikt om de effecten van chemische toxische stoffen op de levensvatbaarheid van volwassen Drosophila melanogaster te beoordelen.
Menselijke industrieën genereren honderdduizenden chemicaliën, waarvan vele niet voldoende zijn bestudeerd voor milieuveiligheid of effecten op de menselijke gezondheid. Dit tekort aan chemische veiligheidsinformatie wordt verergerd door de huidige testmethoden bij zoogdieren die duur, arbeidsintensief en tijdrovend zijn. Onlangs hebben wetenschappers en regelgevers gewerkt aan de ontwikkeling van nieuwe benaderingsmethoden (NAM’s) voor chemische veiligheidstests die goedkoper en sneller zijn en dierenleed verminderen. Een van de belangrijkste NAMs die naar voren komen, is het gebruik van ongewervelde organismen als vervanging voor zoogdiermodellen om geconserveerde chemische werkingsmechanismen op te helderen voor ver verwante soorten, waaronder mensen. Om deze inspanningen te bevorderen, beschrijven we hier een methode die de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, gebruikt om de chemische veiligheid te beoordelen. Het protocol beschrijft een eenvoudige, snelle en goedkope procedure om de levensvatbaarheid en het voedingsgedrag van blootgestelde volwassen vliegen te meten. Bovendien kan het protocol eenvoudig worden aangepast om monsters te genereren voor genomische en metabolomische benaderingen. Over het algemeen betekent het protocol een belangrijke stap voorwaarts in het vaststellen van Drosophila als een standaardmodel voor gebruik in precisietoxicologie.
Mensen worden voortdurend blootgesteld aan chemicaliën uit verschillende bronnen, waaronder lucht1, voedsel2, water3,4, medicijnen5, reinigingsmiddelen6, producten voor persoonlijke verzorging 7, industriële chemicaliën 7 en bouwmaterialen 7. Bovendien worden er elk jaar duizenden nieuwe chemicaliën geïntroduceerd8, waarvan er vele niet goed worden doorgelicht op gezondheids- en milieuveiligheid. Dit gebrek aan adequate chemische veiligheidstests komt deels voort uit een te grote afhankelijkheid van zoogdiermodellen, zoals muizen en ratten. Hoewel dergelijke knaagdiermodellen informatief zijn, zijn chemische veiligheidstests in deze systemen duur, tijdrovend en veroorzaken ze vaak onaanvaardbare niveaus van lijden voor het proefdier9.
De financiële en ethische lasten die gepaard gaan met het testen van de chemische veiligheid van zoogdieren, evenals de tijdrovende aard van zoogdierstudies, zijn belangrijke factoren die bijdragen aan het gebrek aan gegevens over nieuwe chemicaliën. Om dit probleem aan te pakken, implementeren het Amerikaanse Environmental Protection Agency (EPA), het Europees Agentschap voor chemische stoffen (ECHA), Health Canada en andere agentschappen maatregelen die nieuwe aanpakmethoden (NAM’s) opnemen in regelgevingskaders10, waardoor het Noord-Amerikaanse en Europese beleid in overeenstemming wordt gebracht met internationale doelstellingen om het gebruik van dieren te vervangen, te verminderen en te verfijnen (het 3V-principe)11, 12,13,14. NAMs omvatten een verscheidenheid aan assays, voornamelijk gebaseerd op in vitro en in silico-modellen die een mechanistisch begrip van chemische toxiciteit bieden in plaats van het observeren van tegenspoed toegebracht aan zoogdiertestsoorten, waardoor de snelheid van het genereren van gegevens voor chemische risicobeoordeling wordt verhoogd terwijl nog steeds high-fidelity outputs worden geproduceerd15. Het is echter nog niet bewezen dat deze methoden bescherming bieden tegen systemische toxiciteit, met inbegrip van de verstoring van vitale biologische processen waarbij interorganische communicatie en endocriene signalering betrokken zijn. Verder kunnen ze geen rekening houden met de bioaccumulatie van chemicaliën in specifieke weefsels, het vermogen van individuele verbindingen om te worden geabsorbeerd en uitgescheiden, en de wisselwerking tussen gedrag en chemische blootstelling.
Vanwege de beperkingen van in vitro en computationele modellen, moet het succesvolle gebruik van NAMs om zoogdiermodellen te verminderen of te vervangen ook ongewervelde in vivo modellen omvatten, zoals de fruitvlieg, Drosophila melanogaster. Eerdere studies in de vlieg hebben aangetoond dat dit organisme zeer geschikt is voor het bestuderen van de geconserveerde genetische routes die dierlijke cellen beschermen tegen toxische moleculen 16,17,18,19,20,21,22. Bovendien vertoont de vlieg opmerkelijke genetische gelijkenis met mensen, waaronder functionele homologen met meer dan 65% van de menselijke ziekten 23,24,25 en een nog groter behoud van belangrijke functionele routes 26. Deze kenmerken, gecombineerd met hun relatief korte levenscyclus, lage onderhoudskosten en gemakkelijk waarneembare gedragsreacties, maken Drosophila zeer geschikt voor gebruik als een toxicologisch model27,28,29,30. Bovendien hebben vliegen een veel hogere doorvoer dan knaagdiermodellen en vangen ze effecten op het metabolisme, de fysiologie en hormoonsignalering die niet gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd door andere niet-organismale NAMs9.
Het hier beschreven protocol vormt een kader voor het testen van de effecten van chemische blootstelling op volwassen Drosophila. De methode is ontworpen om efficiënt, goedkoop en reproduceerbaar te zijn, terwijl ook de tijd dat onderzoekers in contact moeten komen met de teststof wordt geminimaliseerd en de monsterverzameling voor metabolomica en andere omics-benaderingen wordt geminimaliseerd. Het protocol is geoptimaliseerd voor het testen van een enkele chemische stof per experiment, maar kan gemakkelijk andere experimentele parameters bevatten, zoals verschillende oplosmiddelen of combinaties van chemicaliën.
De fruitvlieg Drosophila melanogaster is in opkomst als een krachtig systeem voor NAMs16,18,19,21. Door gebruik te maken van de ongeëvenaarde genetische bronnen die beschikbaar zijn voor de vlieggemeenschap, gecombineerd met recente vooruitgang in genomica en metabolomica, zijn chemische veiligheidsstudies met behulp van Drosophila in staat om snel de moleculaire mechanismen te identificeren waarmee individuele verbindingen interfereren met metabolisme, fysiologie en celsignalering (zie bijvoorbeeld39). Dit goedkope protocol is ontworpen om snel dosis-responscurven te definiëren en vervolgens monsters te genereren voor RNA-seq- en metabolomics-analyse. Bovendien kan dit flexibele protocol worden aangepast voor gebruik met elk genotype en is het geschikt voor vele klassen chemicaliën.
Een opmerkelijk aspect van dit protocol is de keuze van vloeibaar voedsel dat wordt gebruikt bij de chemische blootstelling, die is gebaseerd op een eerdere studie, maar verschilt van de vaste media die worden gebruikt door de meeste toxicologische studies van Drosophila18,22. Deze specifieke vloeibare media werden geselecteerd om de voedingswaarde weer te geven van de standaard, vaste BDSC-media die de vliegen ook in dit protocol krijgen, om ervoor te zorgen dat de vliegen consistente voeding krijgen. De eenvoud van vloeibare voedingsmedia heeft veel voordelen. Vloeibare media zijn gemakkelijker te hanteren dan vast voedsel, dat moet worden gesmolten en gereconsolideerd of gereconstitueerd uit poeder. Vloeibare media verhogen ook de doorvoer van het systeem, zorgen voor een gelijkmatige chemische verdeling over de voedingsmedia en verminderen de tijd die wordt besteed aan het werken met gevaarlijke verbindingen. Bovendien hoeven de media geen oplossingen te verwarmen, wat het testen van vluchtige teststoffen vergemakkelijkt. Ten slotte worden, vanwege de relatief weinige componenten in de voedseloplossing, ongewenste nevenreacties tussen de teststof en andere voedingscomponenten geminimaliseerd. De gist die in het voedsel wordt gebruikt, is ook inactief, waardoor de reactiviteit van het voedingsmedium verder wordt beperkt. Houd er echter rekening mee dat de methode niet geschikt is voor het testen van ontwikkelings- of larvale toxiciteit.
Sommige van de materialen die in het protocol worden gebruikt, kunnen worden vervangen, zoals het gebruik van glazen vliegenflacons in plaats van polypropyleen. De gebruikte materialen werden echter geselecteerd om zowel inert als wegwerpbaar te zijn om ongewenste chemische reacties tussen reagentia en chemische blootstellingen als gevolg van het reinigen van glaswerk te voorkomen.
Het gebruik van vloeibaar voedsel vereist een voertuig voor voedselbezorging. Celluloseacetaatfilterpapier werd voor dit doel gekozen vanwege zijn flexibiliteit en inerte aard28. Andere onderzoekers gebruikten vergelijkbare protocollen, maar met andere voertuigen, zoals delicate taakdoekjes of glasvezelfilter29,30. Het celluloseacetaatfilterpapier voldeed aan deze behoeften omdat het een inert medium is dat in de ideale vorm kan worden gesneden om het in de bodem van de vliegenflacons te passen zonder grote openingen tussen het papier en de wand van de injectieflacon, waardoor de dood als gevolg van vliegen die vast komen te zitten in media of het voertuig zelf, wordt voorkomen.
Een belangrijke beperking van dit systeem is dat de maximale testbare concentratie van een chemische stof gekoppeld is aan de oplosbaarheid van de chemische stof. Niet-wateroplosbare verbindingen vereisen een extra oplosmiddel, wat kan leiden tot extra of synergetische effecten met de chemische stof van belang. Dit kan ook situaties creëren waarin het niet mogelijk is om stamoplossingen te bereiden die voldoende geconcentreerd zijn om het gewenste eindpunt in alle organismen te bereiken, waardoor de analyse van de resulterende gegevens wordt beperkt31. Om dit aan te pakken, kunnen chemicaliën met een lage oplosbaarheid in water worden getest door tot 0,5% dimethylsulfoxide aan de voedseloplossing toe te voegen. Andere oplosmiddelen kunnen ook worden gebruikt, maar aanvullend onderzoek is nodig voor elk oplosmiddel van belang om de maximaal aanvaardbare oplosmiddelconcentratie in de oplossing te bepalen om de oplosbaarheid te maximaliseren en de effecten van oplosmiddelen op het organisme te minimaliseren.
Uitgebreide karakterisering van de reukrespons in Drosophila heeft beschreven hoe vliegen het consumeren van toxische verbindingen vermijden40,41, wat leidt tot verminderde voeding op behandelde media. De blauwe kleurstoftest pakt dit fenomeen aan door onderzoekers in staat te stellen het voedingsgedrag van de vliegen die elke concentratie experimentele chemische stof 42,43,44 voeden, efficiënt te screenen. De aan- of afwezigheid van blauw in het maagdarmkanaal van de vlieg geeft aan of de vlieg het giftige medium heeft gegeten. Hoewel er meer geavanceerde methoden bestaan om vliegvoergedrag te beoordelen, zoals de Fly Liquid-Food Interaction Counter45, is deze kwalitatieve methode beter geschikt voor screening met een hogere doorvoer.
Een opmerkelijk aspect van dit protocol is dat het is geoptimaliseerd voor een blootstellingsperiode van 48 uur zonder de noodzaak om vliegen over te brengen of extra vloeistof aan de blootstellingsflacon toe te voegen. Het gebruik van een vochtigheidskamer en het plaatsen van de kamers in een incubator met een hoge luchtvochtigheid voorkwam dat het filterpapier met de voedingsmedia gedurende dit tijdsbestek uitdroogde. Het protocol kan worden aangepast voor langere blootstellingsduur, maar de methode moet worden aangepast om ervoor te zorgen dat het filtreerpapier niet droog wordt en significante veranderingen in de concentratie of letaliteit van de oplossing veroorzaakt als gevolg van uitdroging.
Ten slotte is een belangrijk kenmerk van dit protocol dat het gemakkelijk genetische varianten kan accommoderen, waardoor onderzoekers het enorme scala aan genetische hulpmiddelen voor Drosophila kunnen gebruiken om deze voorstudies over wild-type organismen uit te breiden om mechanismen van chemische actie in vivo beter te begrijpen. In dit opzicht kan het hierboven beschreven protocol gemakkelijk worden gewijzigd als aanvulling op een eerder beschreven JoVE-protocol van Peterson en Long dat toxicologische analyse van in het wild gevangen vliegen mogelijk maakt18.
Vanwege de grote verscheidenheid aan eerdere studies over de toxiciteit van natriumarseniet in Drosophila 32,33,34,35,36, werden Oregon-R-vliegen behandeld met deze verbinding om de werkzaamheid van ons systeem aan te tonen. Mannelijke vliegen vertoonden een LD 50 van 0,65 mM en vrouwtjes vertoonden een LD50 van 0,90 mM. Dit komt overeen met eerdere studies van met natriumarseniet behandelde volwassen Drosophila. Goldstein en Babich37 ontdekten bijvoorbeeld dat 50% van de vliegen (gemengde geslachten) stierf na 7 dagen blootstelling aan 0,5 mM NaAsO2. Hoewel dit een iets lagere dosis is dan momenteel werd waargenomen, zijn de verschillen tussen hun methoden en deze methode (inclusief het gebruik van vaste blootstellingsmedia, een langere tijdschaal en gemengde geslachten) waarschijnlijk verantwoordelijk voor dit verschil. Belangrijk is dat beide methoden resulteerden in over het algemeen vergelijkbare LD50-waarden.
Observaties van experimenten met behulp van dit protocol kunnen worden gebruikt om genetische en moleculaire doelen te vinden voor latere gedrags- of mechanistische studies. De blootstellingsmethode kan ook worden gebruikt om Drosophila te behandelen voor bemonstering voor metabolomica en proteomica, waardoor dit protocol zeer geschikt is voor het groeiende veld van precisietoxicologie (gemodelleerd vanuit het precisiegeneeskundeveld46). In dit opzicht kunnen blootgestelde vliegen na stap 8 worden verzameld voor daaropvolgende genomische en metabolomische analyse. Monsters die in stap 8 zijn verzameld, kunnen vervolgens worden verwerkt, zoals beschreven door Li en Tennessen47, te beginnen met stap 3.
Uiteindelijk zouden de gegevens verkregen uit de hierboven beschreven experimenten, evenals eventuele daaropvolgende metabolomics- en proteomics-gegevens, idealiter worden gebruikt in vergelijkingen tussen soorten. Zoals eerder opgemerkt26, zijn dergelijke cross-species studies krachtig en in staat om te bepalen hoe individuele chemicaliën interfereren met geconserveerde biologische routes. Het hierboven beschreven protocol kan dus worden gebruikt om evolutionaire overeenkomsten te vinden in reactie op individuele toxische stoffen in phyla en om de chemische veiligheidsregulering te helpen informeren.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken onze medewerkers voor hulp bij het testen en optimaliseren van dit protocol: Ameya Belamkar, Marilyn Clark, Alexander Fitt, Emma Rose Gallant, Ethan Golditch, Matthew Lowe, Morgan Marsh, Kyle McClung, Andy Puga, Darcy Rose, Cameron Stockbridge en Noelle Zolman. We bedanken ook onze collega’s van de Precision Toxicology Group, met name onze tegenhangers van de Exposure Group, voor het helpen identificeren van de doelen van het protocol.
Dit project ontving financiering van het Horizon 2020 Research and Innovation-programma van de Europese Unie onder Grant Agreement No. 965406. Het werk dat in deze publicatie wordt gepresenteerd, is uitgevoerd als onderdeel van het ASPES-cluster. Deze output weerspiegelt alleen de standpunten van de auteurs en de Europese Unie kan niet verantwoordelijk worden gehouden voor enig gebruik dat kan worden gemaakt van de informatie die erin is opgenomen. Deze publicatie werd ook mogelijk gemaakt met steun van het Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, dat gedeeltelijk wordt gefinancierd door Award Number UL1TR002529 van de National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Delen van dit project werden ondersteund door fondsen van Indiana University toegekend aan JRS en het PhyloTox-consortium. JMH en EMP werden ondersteund door NIH award P40OD018537 aan Bloomington Drosophila Stock Center.
1.5 inch flower lever action craft punch | Bira Craft | HCP-115-024 | |
15 mL Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL |
2 ml Tubes | VWR | 16466-044 | Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom |
5 ml Tubes | VWR | 60818-576 | Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430290 | 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap |
Benchmark Dose Software version 3.2 | U.S. Environmental Protection Agency | ||
Cardboard trays | Genesee Scientific flystuff | 32-122 | trays and dividers for narrow vials |
CO2 gas pads | Genesee Scientific flystuff | 59-114 | FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus |
Combitips advanced, 50 mL | Eppendorf | 0030089693 | Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips |
Cotton balls | Genesee Scientific flystuff | 51-101 | Cotton balls, large, fits narrow vials |
Delicate task wipes | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39" |
Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) | VWR | 89168-888 | Wide |
FD&C Blue No. 1 | Spectrum Chemical | FD110 | CAS number 3844-45-9 |
Flies | BDSC | Stock #2057 | OregonR wildtype |
Gloves (nitrile) | Kimtech | 55082/55081/55083 | Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" |
Grade 1 CHR cellulose chromatography paper | Cytvia | 3001-917 | Sheet, 46 x 57 cm |
Mesh for humidity chamber | |||
Multipette / Repeater (X) stream | Eppendorf | 022460811 | Repeater Xstream |
Plastic grate | Plaskolite | 18469 (from lowes) | Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs |
Plastic trays for glass vials | Genesee Scientific flystuff | 59-207 | Narrow fly vial reload tray |
Polypropylene Drosophila Vial | VWR | 75813-156 | Wide (28.5 mm) |
Rubbermaid tubs | Rubbermaid | 3769017 (from Lowes) | Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H |
Sucrose ultra pure | MP Biomedicals, Inc. | 821721 | |
Tube racks for wide-mouthed tubes | Thermo scientific | 5970-0230 | Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes |
Water Purification System | Millipore Milli-Q | ZMQ560F01 | Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier |
Yeast extract | Acros Organics | 451120050 | CAS number 84604-16-0 |