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생물학

Avaliação da toxicidade química em adultos de Drosophila melanogaster

Published: March 24, 2023
doi:
10.3791/65029
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1Department of Biology,Indiana University, 2Bloomington Drosophila Stock Center, Department of Biology,Indiana University, 3School of Biosciences,University of Birmingham, 4O’Neill School of Public and Environmental Affairs,Indiana University, 5Section of Developmental Genomics, Laboratory of Biochemistry and Genetics, National Institute of Diabetes and Kidney and Digestive Diseases,National Institutes of Health

Summary

Este protocolo descreve um método eficiente e de baixo custo que utiliza meios líquidos para avaliar os efeitos de tóxicos químicos na viabilidade de adultos de Drosophila melanogaster.

Abstract

As indústrias humanas geram centenas de milhares de produtos químicos, muitos dos quais não foram adequadamente estudados quanto à segurança ambiental ou aos efeitos na saúde humana. Esse déficit de informações de segurança química é exacerbado pelos métodos de teste atuais em mamíferos, que são caros, trabalhosos e demorados. Recentemente, cientistas e reguladores têm trabalhado para desenvolver novas metodologias de abordagem (NAMs) para testes de segurança química que são mais baratos, mais rápidos e reduzem o sofrimento animal. Um dos principais NAMs a surgir é o uso de organismos invertebrados como substitutos de modelos de mamíferos para elucidar modos químicos conservados de ação em espécies distantemente relacionadas, incluindo humanos. Para avançar nesses esforços, descrevemos aqui um método que utiliza a mosca-da-fruta, Drosophila melanogaster, para avaliar a segurança química. O protocolo descreve um procedimento simples, rápido e de baixo custo para medir a viabilidade e o comportamento alimentar de moscas adultas expostas. Além disso, o protocolo pode ser facilmente adaptado para gerar amostras para abordagens genômicas e metabolômicas. Em geral, o protocolo representa um passo importante no estabelecimento da Drosophila como um modelo padrão para uso em toxicologia de precisão.

Introduction

Os seres humanos estão constantemente expostos a produtos químicos de uma variedade de fontes, incluindo ar1, alimentos2, água3,4, medicamentos5, agentes de limpeza6, produtos de higiene pessoal 7, produtos químicos industriais 7 e materiais de construção 7. Além disso, milhares de novos produtos químicos são introduzidos todos os anos8, muitos dos quais não são devidamente examinados para a saúde e a segurança ambiental. Essa falta de testes de segurança química adequados decorre, em parte, de uma dependência excessiva de modelos de mamíferos, como camundongos e ratos. Embora esses modelos de roedores sejam informativos, os testes de segurança química nesses sistemas são caros, demorados e muitas vezes causam níveis inaceitáveis de sofrimento ao animal de teste9.

Os encargos financeiros e éticos associados aos testes de segurança química em mamíferos, bem como a natureza demorada dos estudos com mamíferos, são os principais fatores que contribuem para a escassez de dados em torno de novos produtos químicos. Para resolver essa questão, a Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA), a Agência Europeia de Produtos Químicos (ECHA), a Health Canada e outras agências estão implementando medidas que incorporam novas metodologias de abordagem (NAMs) nos marcos regulatórios10, colocando assim a política norte-americana e europeia em linha com os objetivos internacionais de substituir, reduzir e refinar o uso de animais (o princípio dos 3R)11, 12,13,14. Os NAMs englobam uma variedade de ensaios baseados principalmente em modelos in vitro e in silico que fornecem uma compreensão mecanicista da toxicidade química em vez de observar a adversidade infligida às espécies de teste de mamíferos, aumentando assim a taxa de geração de dados para avaliação de risco químico enquanto ainda produzem resultados de alta fidelidade15. No entanto, esses métodos ainda não estão comprovados para salvaguardar contra a toxicidade sistêmica, incluindo a interrupção de processos biológicos vitais envolvendo comunicação interórgãos e sinalização endócrina. Além disso, eles não podem explicar a bioacumulação de produtos químicos dentro de tecidos específicos, a capacidade de compostos individuais serem absorvidos e secretados, e a interação entre comportamento e exposição química.

Devido às limitações dos modelos in vitro e computacionais, o uso bem-sucedido de NAMs para reduzir ou substituir modelos de mamíferos também deve incluir modelos in vivo de invertebrados, como a mosca-da-fruta, Drosophila melanogaster. Estudos prévios na mosca demonstraram que este organismo é adequado para o estudo das vias genéticas conservadas que protegem as células animais contra moléculas tóxicas 16,17,18,19,20,21,22. Além disso, a mosca apresenta notável similaridade genética com humanos, incluindo homólogos funcionais a mais de 65% das doenças humanas 23,24,25 e uma conservação ainda maior de importantes vias funcionais 26. Essas características, combinadas com seu ciclo de vida relativamente curto, baixo custo de manutenção e respostas comportamentais facilmente observáveis, tornam a Drosophila adequada para uso como modelo toxicológico27,28,29,30. Além disso, as moscas têm rendimento muito maior do que os modelos de roedores e capturam efeitos sobre o metabolismo, fisiologia e sinalização hormonal que não são prontamente detectáveis por outros NAMs não organismais9.

O protocolo aqui descrito representa uma estrutura para testar os efeitos da exposição química em adultos de Drosophila. O método é projetado para ser eficiente, barato e reprodutível, ao mesmo tempo em que minimiza o tempo que os pesquisadores devem estar em contato com o produto químico de teste e acomoda a coleta de amostras para metabolômica e outras abordagens ômicas. O protocolo é otimizado para testar um único produto químico por experimento, mas pode facilmente acomodar outros parâmetros experimentais, como solventes variados ou combinações de produtos químicos.

Protocol

OBS: Use luvas de nitrilo em todas as etapas deste protocolo. Use jaleco de laboratório, proteção ocular e/ou respiradores, de acordo com as fichas de dados de segurança para cada produto químico avaliado. 1. Preparação do frasco para injetáveis e da câmara de humidade NOTA: As etapas 1.1-1.5 podem ser concluídas a qualquer momento antes de iniciar as outras seções experimentais. Luvas nitrílicas devem ser usadas em todos os momentos durante a preparação do frasco para injetáveis para evitar contaminação. Empilhe quatro folhas de papel cromatógrafo de celulose grau 1 (ver Tabela de Materiais) e corte-as em 2 em tiras largas. Perfure as pastilhas de papel de filtro em forma de flor usando um puncionador de papel de 1,5 polegadas contendo uma matriz em forma de flor. Use uma cavilha de madeira não envernizada de 22 mm x 220 mm para empurrar o papel de filtro para o fundo de um frasco para injetáveis de polipropileno de 28,5 mm de diâmetro. Confirme se a pilha de papel de filtro está bem localizada na parte inferior do frasco para injetáveis. Guarde os frascos preparados em bandejas de plástico ou papelão e coloque as bandejas em sacos plásticos grandes (~280 mm x 240 mm) até usar. Construa uma câmara de umidade cortando um furo de 120 mm x 280 mm na tampa plástica de uma cuba plástica de 606,24 mm x 225,42 mm x 403,22 mm (consulte Tabela de Materiais). Cole a malha sobre o orifício para permitir o fluxo de ar. Corte uma seção da grade de plástico dos painéis de luz de teto com grelha (originalmente 610 mm x 1220 mm) para caber no fundo da cuba de plástico usada na etapa 1.4.NOTA: Uma variedade de diferentes cubas de plástico e materiais de grade de plástico/metal podem ser usados para construir uma câmara de umidade. 2. Criação de moscas Iniciar culturas de moscas adultas (mínimo de 30 adultos) em frascos de leite de vidro contendo meios padrão Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)31. Feche as garrafas com um plugue de rayon envolto em uma limpeza de tarefa delicada. Não amontoe as garrafas.NOTA: O número de frascos necessários depende do número de exposições químicas que estão a ser realizadas e do genótipo da estirpe de ensaio. Normalmente, várias centenas de moscas podem ser obtidas de uma única garrafa ao usar estoques robustos e fecundos. O ensaio padrão usa moscas selvagens Oregon-R (estoque BDSC #2057), mas qualquer genótipo de interesse pode ser usado com este protocolo. Lembre-se que genótipos comprometidos com baixa fecundidade e/ou viabilidade requerem maior cultivo de frascos. Incubar as bandejas dos frascos de cultura a 25 °C com aproximadamente 60% de umidade e um ciclo claro:escuro de 12:12 h até que o terceiro estádio larval ou os estágios iniciais de pupa sejam observados. Este estágio é identificável pela presença de larvas vagando pelas laterais da garrafa e pelo aparecimento de pupas nas paredes da garrafa.NOTA: Manipule apenas moscas durante o período de luzes acesas do ciclo claro:escuro de 12:12 h. Para estoques robustos, as garrafas atingem esse estágio após 3-4 dias nas condições descritas.Remova moscas adultas e determine a liquidez da mídia. Se o meio flui ao longo da lateral da garrafa quando invertido, o meio é muito líquido. Insira um lenço de limpeza de tarefa delicada ou uma bola de rayon no fundo da garrafa para solidificar o alimento da mosca. Quando as moscas começarem a se fechar, limpe todos os adultos das mamadeiras e permita que as pupas continuem a se fechar por 48 h. Neste ponto, quaisquer adultos retirados das garrafas de cultura podem ser transferidos para novas garrafas para propagar as existências (ver passo 2.1) ou eliminados. Transfira moscas que fecham no período de 48 h para novas garrafas contendo mídia BDSC padrão. Idade por 3 dias.NOTA: Os adultos nestas mamadeiras têm 3-5 dias de idade e podem ser usados nos experimentos de letalidade e alimentação. As garrafas usadas para envelhecer moscas adultas conterão ovos e larvas. Como resultado, essas garrafas podem ser usadas para propagar a próxima geração de moscas. 3. Preparação de moscas para exposição química Anestesiar moscas de 5 a 7 dias com CO2. Classifique as moscas anestesiadas por sexo usando sua genitália. Para assistência com moscas anestesiantes e sexantes, ver referência28. Coloque grupos de 20 moscas machos ou 20 fêmeas em frascos contendo meios BDSC padrão. Feche o frasco para injetáveis com um plugue de rayon e guarde os frascos para injetáveis masculinos e femininos separadamente. Marque os frascos para injetáveis contendo moscas fêmeas com uma listra. Deixe os frascos para injetáveis com moscas machos sem marcação para evitar misturar acidentalmente os sexos.NOTA: O número de frascos para injetáveis que devem ser preparados na etapa 3.2 é determinado pela dimensão das experiências de exposição. Tal como descrito nos passos 5.3 e 5.6, uma experiência típica de determinação da gama para um único produto químico de ensaio requer um mínimo de 40 frascos para injetáveis de machos e 40 frascos para injetáveis de fêmeas. Um experimento padrão de curva dose-resposta, descrito nas etapas 7.4 e 7.8, requer um mínimo de 63 frascos para homens e 63 frascos para mulheres para injetáveis. Conservar os frascos para injetáveis durante 48 h numa incubadora a 25 °C a aproximadamente 60% de humidade e com um ciclo claro:escuro de 12:12 h. Durante esse tempo, apoie a bandeja de frascos separados em um ângulo de 60° para evitar que as moscas fiquem presas no alimento enquanto se recuperam da anestesia.NOTA: Esta etapa permite que as moscas se recuperem da anestesia com CO2 . Não anestesiar as moscas novamente durante o restante do protocolo de exposição. Após o período de recuperação de 48 horas, adicionar 0,75 ml de água purificada estéril aos frascos para injetáveis preparados no passo 1.3. O número de frascos para injetáveis preparados nesta etapa deve ser idêntico ao número de frascos para injetáveis estabelecidos na etapa 3.2. Transfira moscas separadas e combinadas por sexo para o frasco para injetáveis de fome abrindo o frasco para injetáveis de vidro que contém as moscas do passo 3.2, colocando-o na boca do frasco para injetáveis de plástico preparado e, em seguida, batendo o fundo do frasco para injetáveis de plástico contra uma bancada. Feche o frasco para injetáveis de plástico com um tampão de acetato de celulose (vulgarmente conhecido como flug).Registar as moscas perdidas nesta transferência (transferir para registos do número inicial de moscas para cada frasco para injetáveis mais tarde). Marque frascos para injetáveis de fome contendo moscas fêmeas com uma listra. Deixe os frascos para injetáveis com moscas machos sem marcação para evitar misturar acidentalmente os sexos. Prepare a câmara de umidade para exposição noturna. Consulte as etapas 1.4-1.5 para obter uma descrição de como construir esta câmara.Coloque seis toalhas de papel padrão no fundo da câmara de umidade. Mergulhe as toalhas de papel com 100 mL de água. Coloque a grelha de plástico (passo 1.5) sobre as toalhas molhadas para garantir que os frascos para injetáveis não entrem em contacto com as toalhas de papel saturadas. Coloque as bandejas dos frascos para injetáveis de fome numa posição horizontal dentro das câmaras de humidade. Coloque as câmaras de humidade numa incubadora a 25 °C (com aproximadamente 60% de humidade) durante a noite.OBS: O ideal é que o período de inanição noturna dure aproximadamente 16 h; no entanto, o tempo pode ser ajustado para programações de laboratório individuais. 4. Preparação de soluções-estoque NOTA: As moscas são alimentadas com produtos químicos de teste em meio líquido de levedura-sacarose. Esta seção descreve a preparação de soluções-mãe de meios de alimentação concentrados e produtos químicos de teste. Preparar uma solução de levedura-sacarose 4x contendo 16% de sacarose e 6% de extracto de levedura (m/v) (ver Tabela de Materiais) dissolvida em água purificada estéril. Autoclave a solução em um ciclo líquido para o tempo de esterilização apropriado (por exemplo, 40 min para 1 L).NOTA: A solução pode ser feita a granel e armazenada em alíquotas a -20 °C. Descongelar alíquotas individuais 1 dia antes da utilização, colocando-as num frigorífico a 4 °C. Prepare um estoque do produto químico de teste. Para o experimento inicial, a solução-estoque deve ser feita na concentração mais alta para que o produto químico possa ser completamente dissolvido em água.NOTA: Podem ser utilizados outros solventes que não a água para dissolver o produto químico de ensaio. Veja a discussão sobre ressalvas para o uso de solventes alternativos. Preparar uma solução-mãe de corante azul 100x dissolvendo 1 g de FD&C Blue No. 1 (ver Tabela de Materiais) em 10 mL de água purificada estéril.NOTA: A solução-mãe de corante azul pode ser feita a granel e armazenada em alíquotas a 4 °C. 5. Preparação dos frascos para injetáveis de exposição: Experimento de descoberta de intervalo NOTA: As etapas 5 e 6 do protocolo são projetadas para identificar a menor dose de substância química de teste que induz 100% de letalidade e a maior dose que não induz um fenótipo letal. Se estas concentrações já forem determinadas por experiências anteriores, ver os passos 7 e 8 para calcular uma curva dose-resposta. Os meios de exposição devem ser preparados imediatamente antes da adição de moscas aos frascos para injetáveis de exposição. Rotule oito tubos de centrífuga de 15 mL da seguinte forma: (i) nenhum produto químico, (ii) maior concentração, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 e 1:1.000. Preparar o meio de exposição nos tubos de centrífuga marcados a partir do passo 5.1 adicionando primeiro 2,5 ml de solução-mãe de levedura/sacarose 4x a todos os oito tubos marcados.Adicionar 7,5 mL de água purificada estéril ao tubo rotulado como “sem produto químico”. Essa diluição é o controle negativo. Adicionar 7,4 ml da solução-mãe química de ensaio ao tubo rotulado como “concentração mais elevada”. Adicione 100 μL de água purificada estéril a este tubo, para que o volume final seja de 10 mL. Calcular e registar a molaridade do produto químico de ensaio nesta solução.NOTA: A adição de 100 μL de água purificada estéril ao tubo garante que a concentração química nesta etapa seja idêntica à utilizada na etapa 5.5, em que uma solução-mãe de corante azul é adicionada ao meio de exposição como método para avaliar o comportamento alimentar. Adicione a quantidade adequada de solução de estoque químico de teste e água purificada estéril aos tubos restantes. O volume final de cada tubo deve ser de 10 mL. A concentração final dos produtos químicos de ensaio nestes tubos em relação ao tubo de “maior concentração” deve ser 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 e 1:1.000. Preparar e rotular oito frascos para injetáveis de exposição para cada concentração individual de meios de exposição gerados na etapa 5.1. Deve haver oito conjuntos de frascos (64 frascos no total) contendo os seguintes rótulos: sem produto químico, maior concentração, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 e 1:1.000.Pipetar 0,75 ml de meios de exposição preparados no passo 5.2.3 para o conjunto correspondente de frascos para injetáveis de exposição. Rotule oito tubos individuais de 5 mL da seguinte forma: (i) sem produto químico, (ii) maior concentração, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 e 1:1.000. Preparar meios de exposição ao corante azul misturando primeiro 500 μL de 4x solução-mãe de levedura/sacarose e 20 μL de solução-mãe de corante azul em oito tubos marcados de 5 mL.Adicionar 1,48 mL de água purificada estéril ao tubo rotulado como “sem produto químico”. Essa diluição é o controle negativo. Adicionar 1,48 ml da solução-mãe química de ensaio ao tubo rotulado como “concentração mais elevada”. Nenhuma água é adicionada a este tubo. Calcular e registar a molaridade do produto químico de ensaio nesta solução. Adicione a quantidade adequada de solução de estoque químico de teste e água purificada estéril aos tubos restantes. O volume final de cada tubo deve ser de 2 ml. A concentração final do produto químico de ensaio nesses tubos em relação ao tubo de “maior concentração” deve ser 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 e 1:1.000. Preparar e rotular dois frascos para injetáveis de exposição com cada concentração individual de meios de exposição azuis. Deve haver oito conjuntos de frascos (16 frascos no total) contendo os seguintes rótulos: sem produto químico, maior concentração, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 e 1:1.000. A palavra “azul” também deve ser escrita nesses frascos.Pipetar 0,75 ml de meio de exposição azul para o conjunto correspondente de frascos para injetáveis de exposição azul. 6. Exposição química à mosca: experimento de descoberta de alcance Preparar frascos para injetáveis de exposição química utilizando os frascos para injetáveis de moscas famintas durante a noite do passo 3.7 da seguinte forma:Transfira quatro frascos de moscas fêmeas famintas (20 moscas por frasco) em quatro frascos de exposição de cada concentração química. Rotule estes frascos para injetáveis como “femininos”. Use o mesmo método de transferência descrito na etapa 3.5. Transfira quatro frascos para injetáveis de moscas machos famintas (20 moscas por frasco) em quatro frascos de exposição de cada concentração química. Rotule estes frascos para injetáveis como “masculinos”. Use o mesmo método de transferência descrito na etapa 3.5. Preparar frascos para injetáveis de exposição química contendo corante azul utilizando os frascos para injetáveis de moscas famintas durante a noite do passo 3.7 do seguinte modo:Transfira um frasco para injetáveis de moscas fêmeas famintas (20 moscas por frasco) para um frasco para injetáveis de exposição azul para cada concentração química. Rotule este frasco para injetáveis como “feminino”. Use o mesmo método de transferência descrito na etapa 3.5. Transfira um frasco para injetáveis de moscas machos famintas (20 moscas por frasco) para um frasco para injetáveis de exposição azul para cada concentração química. Rotule este frasco para injetáveis como “masculino”. Use o mesmo método de transferência descrito na etapa 3.5. Registre o número de moscas que estão presentes em cada frasco após a transferência e anote o número que morreu ou escapou. Normalmente, todas as 20 moscas devem sobreviver durante a noite à fome e à transferência. Colocar os frascos para injetáveis de exposição horizontalmente em câmaras de humidade recém-preparadas (ver passo 3.6 para a preparação da câmara de humidade). Coloque as câmaras numa incubadora a 25 °C com aproximadamente 60% de humidade e um ciclo claro:escuro de 12:12 horas. Examinar os frascos para injetáveis de exposição 24 e 48 h após o início da exposição química. Conte e registre o número de moscas mortas em cada frasco para injetáveis em cada ponto de tempo.NOTA: A morte é usada como leitura para este ensaio, mas o protocolo pode ser adaptado para examinar outros fenótipos. Moscas expostas são comumente coletadas nesses momentos para estudos transcriptômicos e metabolômicos. Examine os frascos para injetáveis de exposição azul 24 h após o início da exposição química. Use as seguintes técnicas para determinar se as moscas expostas consumiram o meio de exposição azul:Examine as paredes do frasco para injetáveis em busca de indicações de fezes azuis, que aparecem como pequenos pontos na lateral do frasco para injetáveis de exposição, bem como no flug. Anestesiar as moscas com CO2 e examinar os abdômen para a presença de corante azul.NOTA: Normalmente, os frascos de exposição azul são analisados após 24 horas. No entanto, essa etapa poderia ser realizada em 48 h. As moscas que comeram normalmente têm uma faixa azul através do abdômen, indicando que o meio de exposição entrou no intestino. Examinar as moscas em busca de comportamentos alimentares anormais, como regurgitação, distensão da cultura e quebra da função de barreira intestinal (indicada pelo aparecimento de corante azul em todo o organismo, em vez de apenas limitado ao trato gastrointestinal, comumente referido como smurfing32,33). Descarte todos os frascos contaminados, papel de filtro, flugs e moscas em recipientes apropriados para resíduos químicos. Se as moscas vivas permanecerem nos frascos para injetáveis, congele os frascos para matar as moscas antes de descartá-las no recipiente de lixo adequado.NOTA: O descarte de frascos de exposição e moscas é ditado pelo(s) químico(s) analisado(s) no experimento. Siga sempre os procedimentos de segurança química descritos na ficha de dados de segurança química. Se as concentrações utilizadas na gama de detecção de experiências matarem moscas na dose mais baixa, repita a secção 6 utilizando uma série de diluição, começando com a concentração mais baixa que matou 100% dos animais. 7. Preparação dos frascos de exposição: Gerando uma curva dose-resposta NOTA: O protocolo descrito nas etapas 5 e 6 é projetado para determinar amplamente a concentração química necessária para eliciar um fenótipo. As etapas 7 e 8 do protocolo são utilizadas para calcular uma curva dose-resposta precisa. Calcular as concentrações químicas de ensaio que devem ser analisadas para gerar uma curva dose-resposta utilizando o seguinte método:Determinar a menor concentração do produto químico de teste que mata 100% das moscas expostas em 48 h. Determinar a concentração mais elevada de produto químico de ensaio que não tem efeito sobre a viabilidade em 48 h. Calcular quatro concentrações adicionais que estão igualmente distribuídas entre as concentrações determinadas nos passos 7.1.1 e 7.1.2. Rotular nove tubos de centrifugação individuais de 15 ml com a molaridade das seguintes concentrações: (i) nenhuma substância química, (ii) concentração determinada na etapa 7.1.1, (iii) concentração determinada na etapa 7.1.2, (iv) concentrações determinadas na etapa 7.1.3, (v) duas vezes a concentração determinada na etapa 7.1.1, (vi) uma diluição de 1:2 da concentração determinada na etapa 7.1.2.NOTA: A inclusão das concentrações que são o dobro da concentração determinada no ponto 7.1.1 e uma diluição de 1:2 da determinada no passo 7.1.2 é importante para calcular com precisão a curva dose-resposta. Preparar o meio de exposição adicionando primeiro 2,5 ml de solução-mãe de levedura/sacarose a nove tubos de centrifugação individuais marcados de 15 ml, preparados no passo 7.2.Adicionar 7,5 mL de água purificada estéril ao tubo rotulado como “sem produto químico”. Essa diluição é o controle negativo. Adicione a quantidade adequada de solução de estoque químico de teste e água purificada estéril aos tubos restantes. O volume final de cada tubo deve ser de 10 mL. A concentração final de produto químico dentro de um tubo individual deve ser igual à escrita na parte externa do tubo. Preparar e rotular 12 frascos para injetáveis de exposição para cada concentração de meios de exposição gerados na etapa 7.2. Deve haver nove conjuntos de frascos (108 frascos no total). Pipetar 0,75 ml de meio de exposição para o conjunto correspondente de frascos para injetáveis de exposição.Observação : etapas 7.6 a 7.8 são opcionais. Se se souber que as concentrações químicas de ensaio preparadas na etapa 7.2 não afectam o comportamento alimentar, estas etapas podem ser ignoradas. Preparar e rotular nove tubos diferentes de 5 ml para meios de exposição azuis com a mesma série de concentrações utilizadas no passo 7.2. Preparar o meio de exposição ao corante azul misturando primeiro 500 μL de 4x solução-mãe de levedura/sacarose e 20 μL de solução-mãe de corante azul.Adicionar 1,48 mL de água estéril purificada ao tubo rotulado como “sem produto químico”. Essa diluição é o controle negativo. Adicionar a quantidade adequada de solução de reserva química de ensaio e água estéril purificada aos tubos restantes. O volume final de cada tubo deve ser de 2 mL. A concentração final de produto químico dentro de um tubo individual deve ser igual à escrita na parte externa do tubo. Preparar e rotular dois frascos para injetáveis de exposição para cada concentração individual de meios de exposição azuis. Devem existir nove conjuntos de frascos para injetáveis (18 frascos para injetáveis no total), com cada conjunto de frascos rotulado com as concentrações indicadas no passo 7.2. A palavra “azul” também deve ser escrita nesses frascos.Pipetar 0,75 ml de meio de exposição azul para o conjunto correspondente de frascos para injetáveis de exposição azul. 8. Exposição química à mosca: Gerando uma curva dose-resposta Preparar frascos para injetáveis de exposição química utilizando os frascos para injetáveis de moscas famintas durante a noite do passo 3.7 da seguinte forma:Transfira seis frascos de moscas fêmeas famintas (20 moscas por frasco) em seis frascos de exposição de cada concentração química. Rotule estes frascos para injetáveis como “femininos”. Use o mesmo método de transferência descrito na etapa 3.5. Transfira seis frascos de moscas machos famintas (20 moscas por frasco) em seis frascos de exposição de cada concentração química. Rotule estes frascos para injetáveis como “masculinos”. Use o mesmo método de transferência descrito na etapa 3.5. Preparar frascos para injetáveis de exposição química contendo corante azul utilizando os frascos para injetáveis de moscas famintas durante a noite do passo 3.7 do seguinte modo:Transfira um frasco para injetáveis de moscas fêmeas famintas (20 moscas por frasco) para um frasco para injetáveis de exposição azul para cada concentração química. Rotule este frasco para injetáveis como “feminino”. Use o mesmo método de transferência descrito na etapa 3.5. Transfira um frasco para injetáveis de moscas machos famintas (vinte moscas por frasco) para um frasco de exposição azul para cada concentração química. Rotule este frasco para injetáveis como “masculino”. Use o mesmo método de transferência descrito na etapa 3.5. Registar o número de moscas presentes em cada frasco para injetáveis após a transferência. Normalmente, todas as 20 moscas devem sobreviver à fome e transferência durante a noite, mas garantir que todas as que morreram ou escaparam durante a transferência sejam subtraídas do total. Colocar os frascos para injetáveis de exposição horizontalmente em câmaras de humidade recém-preparadas (ver passo 3.6 para a preparação da câmara de humidade). Coloque as câmaras numa incubadora a 25 °C com aproximadamente 60% de humidade e um ciclo claro:escuro de 12:12 horas. Examinar os frascos para injetáveis de exposição 24 e 48 h após o início da exposição química. Conte e registre o número de moscas mortas em cada frasco para injetáveis em cada ponto de tempo. Examine os frascos para injetáveis de exposição azul 24 h após o início da exposição química. Use o método descrito na etapa 6.6 para avaliar mudanças no comportamento alimentar. Descarte todos os frascos contaminados, papel de filtro, flugs e moscas em recipientes apropriados para resíduos químicos. Se as moscas vivas permanecerem nos frascos para injetáveis, congele os frascos para matar as moscas antes de descartá-las no recipiente de resíduos adequado.NOTA: O descarte de frascos de exposição e moscas é ditado pelo(s) químico(s) analisado(s) no experimento. Siga sempre os procedimentos de segurança química descritos na ficha de dados de segurança química. 9. Cálculo de uma curva dose-resposta Use o Benchmark Dose Software (BMDS, versão 3.2; ver Tabela de Materiais) ou outro software similar para analisar os dados34. A seguir descrevemos o fluxo de trabalho usando o software BMDS. Clique na guia Dados do BMDS e clique em inserir novo conjunto de dados. Insira o número de amostras no conjunto de dados, clique em dicotômico e, em seguida, clique em criar conjunto de dados. Insira cada réplica como uma linha individual no conjunto de dados. Introduzir a dose na primeira coluna do quadro gerado, o número inicial de moscas excluindo as que morreram ou foram perdidas antes do passo 8.3) na segunda coluna e o número de moscas que morreram devido à exposição química na terceira coluna. Clique na guia Principal do BMDS. Clique na seta suspensa para o menu Selecionar tipo de modelo e clique em Dicotômico. Clique em ativar para o conjunto de dados da etapa 9.2 na tabela Conjuntos de dados. Clique nas caixas para os modelos desejados para análise na tabela MLE e Alternativas.NOTA: O modelo Frequentist Restricted Dichotomous Hill foi usado primariamente. Clique em Executar análise. O programa irá gerar um arquivo de saída com a(s) curva(s) de letalidade e detalhes adicionais sobre o(s) modelo(s).

Representative Results

A mosca tem servido de modelo em estudos para determinação da toxicidade do arsenito de sódio (NaAsO2)35,36,37,38. Para demonstrar a eficácia do protocolo, moscas machos e fêmeas foram expostos ao NaAsO2, com o objetivo de comparar esses resultados com estudos anteriores. Usando a metodologia descrita acima, machos e fêmeas adultos de Oregon-R (BDSC stock #2057) foram expostos a uma faixa de concentrações de NaAsO 2 (0, 0,01, 0,02, 0,1, 0,2, 1 e2 mM) e pontuados para letalidade 48 h após o início da exposição (Figura 1A,B). O objetivo desta análise inicial foi identificar a faixa aproximada de concentrações que permitisse uma caracterização mais precisa da toxicidade do NaAsO2. Nos experimentos subsequentes, foram selecionadas concentrações (0, 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 e 5 mM) que definiram com maior precisão a curva dose-resposta NaAsO2 (Figura 1C,D). Note-se que a análise resultante examinou várias concentrações que induziram 100% de letalidade. Os dados foram analisados utilizando-se o software de dose de referência da Agência de Proteção Ambiental, versão 3.2.0.125. Os dados foram modelados como “dicotômicos” e o modelo de Hill Dicotômico foi utilizado para análises subsequentes. Com base nesse modelo, as DL10, DL25 e DL 50 finais de moscas machos alimentadas com NaAsO2 foram 0,30 mM,0,50 mM e 0,65 mM, respectivamente. Para as moscas fêmeas, esses valores foram ligeiramente maiores, com DL10 de 0,30 mM, DL25 de 0,65 mM e DL50 de 0,90 mM. De modo geral, os valores obtidos por esse método são semelhantes aos previamente relatados para toxicidade por arsênio em Drosophila melanogaster35,36,37,38, validando a metodologia. Além das seis repetições usadas para calcular a curva dose-resposta, moscas machos e fêmeas também foram alimentadas com soluções de exposição ao NaAsO2 que continham 1% de FD&C blue, que é facilmente visível no trato digestivo usando microscopia de luz. Com base na presença de corante azul no intestino de moscas alimentadas com NaAsO 2, moscas machos e fêmeas continuaram a se alimentar 24 h após o início da exposição química, independentemente da concentração de NaAsO 2 presente no meio líquido (Figura 2). Entretanto, observou-se que o alimento ingerido era ocasionalmente regurgitado em doses superiores a 0,2 mM para fêmeas e 0,5 mM para machos (Figura 2). Esses achados sugerem que a regurgitação pode ter um papel fundamental na resposta de Drosophila ao envenenamento por arsênico. Figura 1: Curvas dose-resposta para Drosophila machos e fêmeas tratados com NaAsO2 por 48 h. Todos os gráficos mostram as proporções estimadas de moscas mortas em cada concentração de NaAsO2 testada com base no modelo Dicotômico Hill. (A,B) Uma ampla faixa de concentrações de NaAsO2 foi testada para aproximar a dose em que cada sexo de mosca começa a morrer. (A) mostra os dados masculinos e (B) mostra os dados femininos. N = 4 frascos para injetáveis, com 20 moscas por frasco. (C,D) Uma faixa mais estreita de concentrações de NaAsO2 foi testada para determinar doses precisas nas quais 10%, 25% e 50% de cada sexo de moscas morreram. Essas doses são indicadas à direita de cada gráfico. (C) mostra os dados masculinos e (D) mostra os dados femininos. N = 6 frascos para injetáveis, com 20 moscas por frasco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Resultados representativos do ensaio de corante azul de Drosophila machos e fêmeas tratados com NaAsO2 por 24 h. Micrografias mostram moscas alimentadas com concentrações crescentes de NaAsO2. A linha (A) mostra moscas machos, e a linha (B) mostra moscas fêmeas, com a concentração de NaAsO2 aumentando da esquerda para a direita. O abdome mostra uma pequena quantidade de azul perto do tórax em baixas concentrações, indicando que o meio de exposição entrou no intestino. Em concentrações mais elevadas, o corante azul começa a se acumular ao redor da boca, sugerindo que o meio de exposição está sendo regurgitado. A barra de escala é de 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A mosca-das-frutas Drosophila melanogaster está emergindo como um poderoso sistema para NAMs16,18,19,21. Aproveitando os recursos genéticos incomparáveis disponíveis para a comunidade de moscas, combinados com os recentes avanços em genômica e metabolômica, os estudos de segurança química usando Drosophila são capazes de identificar rapidamente os mecanismos moleculares pelos quais compostos individuais interferem no metabolismo, fisiologia e sinalização celular (por exemplo, ver39). Este protocolo de baixo custo é projetado para definir rapidamente curvas dose-resposta e, posteriormente, gerar amostras para análise de RNA-seq e metabolômica. Além disso, este protocolo flexível pode ser adaptado para uso com qualquer genótipo e pode acomodar muitas classes de produtos químicos.

Um aspecto notável desse protocolo é a escolha do alimento líquido utilizado na exposição química, que é baseado em estudo anterior, mas difere do meio sólido utilizado pela maioria dos estudos toxicológicos de Drosophila 18,22. Este meio líquido específico foi selecionado para refletir o conteúdo nutricional do meio BDSC sólido padrão que as moscas também são alimentadas neste protocolo, para garantir que as moscas recebam nutrição consistente. A simplicidade dos meios de alimentação líquida tem muitas vantagens. O meio líquido é mais fácil de manusear do que os alimentos sólidos, que precisam ser fundidos e ressolidificados ou reconstituídos a partir de pó. O meio líquido também aumenta o rendimento do sistema, garante uma distribuição uniforme de produtos químicos por todo o meio de alimentação e diminui o tempo gasto trabalhando com compostos perigosos. Além disso, o meio não requer soluções para ser aquecido, o que facilita o teste de compostos voláteis de teste. Finalmente, devido aos relativamente poucos componentes incluídos na solução alimentar, as reações colaterais indesejáveis são minimizadas entre o produto químico de teste e outros componentes da dieta. A levedura utilizada no alimento também é inativa, limitando ainda mais a reatividade do meio de alimentação. No entanto, observe que o método não é adequado para testar a toxicidade do desenvolvimento ou larval.

Alguns dos materiais usados no protocolo podem ser substituídos, como o uso de frascos de mosca de vidro em vez de polipropileno. No entanto, os materiais utilizados foram selecionados para serem inertes e descartáveis para evitar reações químicas indesejadas entre reagentes e exposições químicas que poderiam resultar da limpeza de vidraria.

O uso de alimentos líquidos requer um veículo para entrega de alimentos. O papel de filtro acetato de celulose foi selecionado para esse fim devido à sua flexibilidade e natureza inerte28. Outros pesquisadores utilizaram protocolos semelhantes, porém com outros veículos, como lenços umedecidos ou filtro de fibra de vidro29,30. O papel de filtro acetato de celulose atendeu a essas necessidades porque é um veículo inerte que pode ser cortado na forma ideal para encaixá-lo no fundo dos frascos de mosca sem grandes lacunas entre o papel e a parede do frasco, evitando a morte devido a moscas ficarem presas na mídia ou no próprio veículo.

Uma limitação importante deste sistema é que a concentração máxima testável de um produto químico está ligada à solubilidade do produto químico. Compostos não solúveis em água requerem um solvente adicional, o que pode levar a efeitos adicionais ou sinérgicos com a substância química de interesse. Isso também pode criar situações em que não é possível preparar soluções estoque suficientemente concentradas para atingir o desfecho desejado em todos os organismos, limitando a análise dos dados resultantes31. Para resolver isso, produtos químicos com baixa solubilidade em água podem ser testados adicionando até 0,5% de dimetilsulfóxido à solução alimentar. Outros solventes também podem ser usados, mas pesquisas adicionais são necessárias para cada solvente de interesse para determinar a concentração máxima aceitável de solvente dentro da solução para maximizar a solubilidade enquanto minimiza os efeitos do solvente no organismo.

A extensa caracterização da resposta olfativa em Drosophila descreveu como as moscas evitam o consumo de compostos tóxicos40,41, levando à redução da alimentação nos meios tratados. O ensaio do corante azul aborda esse fenômeno, permitindo aos pesquisadores rastrear eficientemente o comportamento alimentar das moscas alimentadas com cada concentração de produto químico experimental42,43,44. A presença ou ausência de azul no trato gastrointestinal da mosca indica se a mosca tem comido o meio contendo tóxico. Embora existam métodos mais sofisticados de avaliação dos comportamentos alimentares das moscas, como o Fly Liquid-Food Interaction Counter45, esse método qualitativo é mais adequado para triagem de maior rendimento.

Um aspecto notável deste protocolo é que ele foi otimizado para um período de exposição de 48 h sem a necessidade de transferir moscas ou adicionar líquido adicional ao frasco de exposição. O uso de uma câmara de umidade e a colocação das câmaras em uma incubadora mantida em alta umidade evitaram que o papel de filtro contendo o meio de alimentação secasse durante esse período. O protocolo pode ser adaptado para períodos de exposição mais longos, mas o método deve ser ajustado para garantir que o papel de filtro não fique seco e cause alterações significativas na concentração da solução ou letalidade devido à dessecação.

Finalmente, uma característica importante deste protocolo é que ele pode acomodar prontamente variantes genéticas, o que permite que os pesquisadores utilizem a vasta gama de ferramentas genéticas para Drosophila para expandir esses estudos preliminares em organismos selvagens para entender melhor os mecanismos de ação química in vivo. Nesse sentido, o protocolo descrito acima poderia ser facilmente modificado para complementar um protocolo JoVE previamente descrito por Peterson e Long que permite a análise toxicológica de moscas capturadas na natureza18.

Devido à grande variedade de estudos prévios sobre a toxicidade do arsenito de sódio em Drosophila 32,33,34,35,36, moscas Oregon-R foram tratadas com este composto para demonstrar a eficácia do nosso sistema. Os machos exibiram uma DL 50 de 0,65 mM, e as fêmeas exibiram uma DL50 de 0,90 mM. Isso se alinha com estudos anteriores de Drosophila adulta tratada com arsenito de sódio. Por exemplo, Goldstein e Babich37 encontraram que 50% das moscas (sexos mistos) morreram após 7 dias de exposição a NaAsO0,5 mM 2. Embora esta seja uma dose ligeiramente menor do que a observada atualmente, as diferenças entre seus métodos e esse método (incluindo o uso de meios de exposição sólidos, uma escala de tempo mais longa e sexos mistos) provavelmente explicam essa diferença. É importante ressaltar que ambos os métodos resultaram em valores globais de DL50 semelhantes.

Observações de experimentos usando este protocolo podem ser usadas para encontrar alvos genéticos e moleculares para estudos comportamentais ou mecanísticos subsequentes. O método de exposição também pode ser usado para tratar Drosophila para amostragem para metabolômica e proteômica, tornando este protocolo bem adequado para o crescente campo da toxicologia de precisão (modelado a partir do campo da medicina de precisão46). Nesse sentido, moscas expostas podem ser coletadas após a etapa 8 para posterior análise genômica e metabolômica. As amostras coletadas na etapa 8 podem então ser processadas, conforme descrito por Li e Tennessen47, começando com a etapa 3.

Em última análise, os dados adquiridos a partir dos experimentos descritos acima, bem como quaisquer dados metabolômicos e proteômicos subsequentes, seriam idealmente usados em comparações entre espécies. Como observado anteriormente26, tais estudos entre espécies são poderosos e capazes de determinar como substâncias químicas individuais interferem em vias biológicas conservadas. Assim, o protocolo descrito acima pode ser usado para encontrar semelhanças evolutivas em resposta a tóxicos individuais em todos os filos e ajudar a informar a regulamentação de segurança química.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos à nossa equipe pela ajuda com os testes e otimização deste protocolo: Ameya Belamkar, Marilyn Clark, Alexander Fitt, Emma Rose Gallant, Ethan Golditch, Matthew Lowe, Morgan Marsh, Kyle McClung, Andy Puga, Darcy Rose, Cameron Stockbridge e Noelle Zolman. Agradecemos também aos nossos colegas do Grupo de Toxicologia de Precisão, particularmente aos nossos colegas do Grupo de Exposição, por ajudarem a identificar os objetivos do protocolo.

Este projeto recebeu financiamento do programa de Investigação e Inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do Acordo de Subvenção n.º 965406. O trabalho apresentado nesta publicação foi realizado como parte do Cluster ASPIS. Esta produção reflete apenas a opinião dos autores, e a União Europeia não pode ser responsabilizada por qualquer uso que possa ser feito das informações nele contidas. Esta publicação também foi possível com o apoio do Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, que é financiado em parte pelo Prêmio Número UL1TR002529 dos Institutos Nacionais de Saúde, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do National Institutes of Health. Partes deste projeto foram apoiadas por fundos da Universidade de Indiana concedidos ao JRS e ao consórcio PhyloTox. JMH e EMP foram apoiados pelo NIH P40OD018537 de premiação para o Bloomington Drosophila Stock Center.

Materials

1.5 inch flower lever action craft punch Bira Craft HCP-115-024
15 mL Centrifuge Tubes  VWR 89039-666 High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL
2 ml Tubes  VWR 16466-044 Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom
5 ml Tubes  VWR  60818-576 Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps
50 mL Centrifuge Tubes  Corning  430290 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap
Benchmark Dose Software version 3.2 U.S. Environmental Protection Agency
Cardboard trays Genesee Scientific flystuff 32-122 trays and dividers for narrow vials 
CO2 gas pads Genesee Scientific flystuff 59-114 FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus 
Combitips advanced, 50 mL Eppendorf  0030089693 Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips
Cotton balls Genesee Scientific flystuff 51-101 Cotton balls, large, fits narrow vials 
Delicate task wipes Kimtech 34155 Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39"
Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) VWR 89168-888 Wide
FD&C Blue No. 1 Spectrum Chemical FD110 CAS number 3844-45-9
Flies  BDSC Stock #2057  OregonR wildtype 
Gloves (nitrile) Kimtech 55082/55081/55083 Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" 
Grade 1 CHR cellulose chromatography paper Cytvia 3001-917 Sheet, 46 x 57 cm
Mesh for humidity chamber
Multipette / Repeater (X) stream  Eppendorf  022460811 Repeater Xstream 
Plastic grate Plaskolite 18469 (from lowes) Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs
Plastic trays for glass vials Genesee Scientific flystuff 59-207 Narrow fly vial reload tray 
Polypropylene Drosophila Vial VWR 75813-156 Wide (28.5 mm)
Rubbermaid tubs Rubbermaid 3769017 (from Lowes) Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H
Sucrose ultra pure MP Biomedicals, Inc. 821721
Tube racks for wide-mouthed tubes Thermo scientific  5970-0230 Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes 
Water Purification System Millipore Milli-Q ZMQ560F01 Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier 
Yeast extract Acros Organics 451120050 CAS number 84604-16-0
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Holsopple, J. M., Smoot, S. R., Popodi, E. M., Colbourne, J. K., Shaw, J. R., Oliver, B., Kaufman, T. C., Tennessen, J. M. Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (193), e65029, doi:10.3791/65029 (2023).
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