该协议描述了一种有效且廉价的方法,该方法使用液体培养基来评估化学毒物对成年 黑腹果蝇活力的影响。
人类工业产生数十万种化学物质,其中许多尚未对环境安全或对人类健康的影响进行充分研究。目前在哺乳动物身上的测试方法昂贵、劳动密集型和耗时,加剧了这种化学安全信息的缺乏。最近,科学家和监管机构一直致力于开发用于化学安全测试的新方法(NAM),这些方法更便宜,更快速,并减少动物的痛苦。即将出现的关键不结盟运动之一是使用无脊椎动物生物作为哺乳动物模型的替代品,以阐明包括人类在内的远亲物种的保守化学作用模式。为了推进这些努力,在这里,我们描述了一种使用果蝇 Drosophila melanogaster来评估化学安全性的方法。该协议描述了一种简单,快速且廉价的程序,用于测量暴露的成年果蝇的生存能力和摄食行为。此外,该协议可以很容易地适应于生成基因组和代谢组学方法的样品。总体而言,该协议代表了将 果蝇 建立为用于精密毒理学的标准模型的重要一步。
人类经常接触各种来源的化学物质,包括空气1、食物2、水3、4、药物5、清洁剂6、个人护理产品7、工业化学品7和建筑材料7。此外,每年引入数千种新化学品8,其中许多未经适当的健康和环境安全审查。缺乏足够的化学安全性测试部分源于过度依赖哺乳动物模型,如小鼠和大鼠。虽然这种啮齿动物模型提供了丰富的信息,但这些系统中的化学安全测试昂贵、耗时,并且经常给试验动物带来不可接受的痛苦程度9。
与哺乳动物化学品安全测试相关的财政和伦理负担,以及哺乳动物研究的耗时性,是导致新化学品数据匮乏的主要因素。为了解决这个问题,美国环境保护署(EPA)、欧洲化学品管理局(ECHA)、加拿大卫生部和其他机构正在实施将新方法(NAM)纳入监管框架的措施10,从而使北美和欧洲的政策符合替代,减少和改进动物使用的国际目标(3R原则)11,12,13,14.NAM包括主要基于体外和计算机模型的各种测定,这些分析提供了对化学毒性的机理理解,而不是观察对哺乳动物测试物种造成的逆境,从而提高了化学风险评估的数据生成率,同时仍产生高保真输出15.然而,这些方法尚未被证明可以防止全身毒性,包括涉及器官间通讯和内分泌信号传导的重要生物过程的破坏。此外,它们无法解释特定组织中化学物质的生物积累,单个化合物被吸收和分泌的能力以及行为与化学品暴露之间的相互作用。
由于体外和计算模型的局限性,成功利用NAMs减少或替代哺乳动物模型还应包括无脊椎动物体内模型,如果蝇、黑腹果蝇等。先前的飞行研究表明,这种生物非常适合研究保护动物细胞免受有毒分子侵害的保守遗传途径16,17,18,19,20,21,22。此外,苍蝇显示出与人类的显着遗传相似性,包括超过65%的人类疾病的功能同源物23,24,25,以及重要功能通路的更大保护性26。这些特征,加上它们相对较短的生命周期、低维护成本和易于观察到的行为反应,使果蝇非常适合用作毒理学模型27,28,29,30。此外,苍蝇的通量比啮齿动物模型高得多,并且可以捕获其他非有机体NAM不容易检测到的新陈代谢,生理和激素信号传导的影响9。
此处描述的方案代表了一个框架,用于测试化学暴露对成年 果蝇的影响。该方法旨在高效、廉价且可重现,同时还最大限度地减少了研究人员必须与测试化学品接触的时间,并适应代谢组学和其他组学方法的样品收集。该方案针对每个实验测试一种化学物质进行了优化,但可以轻松适应其他实验参数,例如各种溶剂或化学品组合。
果蝇黑腹果蝇正在成为NAMs的强大系统16,18,19,21。通过利用苍蝇群落可用的无与伦比的遗传资源,结合基因组学和代谢组学的最新进展,使用果蝇的化学安全性研究能够快速识别单个化合物干扰代谢、生理和细胞信号传导的分子机制(例如,见39).这种廉价的方案旨在快速定义剂量反应曲线,并随后生成用于RNA-seq和代谢组学分析的样品。此外,这种灵活的方案可以适用于任何基因型,并且可以适应许多类别的化学品。
该协议的一个值得注意的方面是化学暴露中使用的液体食物的选择,这是基于以前的研究,但与果蝇18,22的大多数毒理学研究使用的固体培养基不同。选择这种特定的液体培养基以反映标准固体BDSC培养基的营养成分,该培养基在该协议中也喂食苍蝇,以确保苍蝇获得一致的营养。液体进料介质的简单性具有许多优点。液体介质比固体食品更容易处理,固体食品需要融化和重新固化或从粉末中重组。液体介质还可以提高系统的通量,确保整个进料介质中的均匀化学品分布,并减少处理有害化合物所花费的时间。此外,介质不需要加热溶液,这有助于测试挥发性测试化合物。最后,由于食品溶液中包含的成分相对较少,因此测试化学品和其他膳食成分之间的不良副反应最小化。食品中使用的酵母也是无活性的,进一步限制了喂养培养基的反应性。但是,请注意,该方法不适合测试发育或幼虫毒性。
协议中使用的一些材料可以替代,例如使用玻璃飞瓶而不是聚丙烯。然而,所使用的材料被选择为惰性和一次性的,以避免试剂之间不必要的化学反应和清洁玻璃器皿可能导致的化学暴露。
使用液体食品需要一种送餐工具。为此目的选择了醋酸纤维素滤纸,因为它具有柔韧性和惰性28。其他研究人员使用类似的协议,但使用其他车辆,例如精致的任务湿巾或玻璃纤维过滤器29,30。醋酸纤维素滤纸满足了这些需求,因为它是一种惰性载体,可以切割成理想的形状,以将其放入飞瓶的底部,纸和小瓶壁之间没有大的间隙,防止由于苍蝇卡在介质或载体本身中而死亡。
该系统的一个重要限制是化学品的最大可测试浓度与化学品的溶解度有关。非水溶性化合物需要额外的溶剂,这可能导致与目标化学品的额外或协同效应。这也可能导致无法制备足够浓缩以在所有生物体中达到所需终点的储备溶液的情况,因此限制了对结果数据的分析31。为了解决这个问题,可以通过向食品溶液中添加高达0.5%的二甲基亚砜来测试水溶性低的化学品。也可以使用其他溶剂,但需要对每种感兴趣的溶剂进行额外的研究,以确定溶液中可接受的最大溶剂浓度,以最大限度地提高溶解度,同时最大限度地减少溶剂对生物体的影响。
对果蝇嗅觉反应的广泛表征描述了果蝇如何避免食用有毒化合物40,41,从而减少对处理培养基的摄食。蓝色染料测定通过允许研究人员有效地筛选喂食每种浓度的实验化学品42,43,44的苍蝇的摄食行为来解决这一现象。苍蝇胃肠道中是否存在蓝色表明苍蝇是否一直在食用含有有毒物质的培养基。尽管存在更复杂的评估苍蝇摄食行为的方法,例如苍蝇液体 – 食物相互作用计数器45,但这种定性方法更适合更高通量的筛选。
该协议的一个值得注意的方面是,它已针对48小时暴露期进行了优化,而无需转移苍蝇或向暴露瓶中添加额外的液体。使用湿度室并将湿度室放置在保持高湿度的培养箱中可防止包含进料介质的滤纸在此期间变干。该方案可以适用于更长的暴露时间,但必须调整方法以确保滤纸不会变干,也不会因干燥而导致溶液浓度或致死率发生显着变化。
最后,该协议的一个重要特征是它可以很容易地适应遗传变异,这使得研究人员能够利用果 蝇 的大量遗传工具来扩展这些对野生型生物的初步研究,以更好地了解 体内化学作用的机制。在这方面,可以很容易地修改上述协议,以补充Peterson和Long先前描述的JoVE协议,该协议允许对野生捕获的苍蝇进行毒理学分析18。
由于以前对果蝇32,33,34,35,36中亚砷酸钠毒性的研究多种多样,因此俄勒冈R苍蝇用这种化合物处理以证明我们系统的功效。雄性苍蝇的LD 50为0.65 mM,雌性苍蝇的LD50为0.90 mM。这与以前对亚砷酸钠处理的成年果蝇的研究一致。例如,Goldstein和Babich37发现50%的苍蝇(混合性别)在暴露于0.5mM NaAsO27天后死亡。虽然这比目前观察到的剂量略低,但他们的方法和这种方法之间的差异(包括使用固体暴露介质,更长的时间尺度和混合性别)可能解释了这种差异。重要的是,这两种方法都产生了总体相似的LD50值。
使用该协议的实验观察可用于为后续的行为或机制研究找到遗传和分子靶标。暴露方法也可用于治疗 果蝇 以进行代谢组学和蛋白质组学的采样,使该协议非常适合不断发展的精准毒理学领域(从精准医学领域建模46)。在这方面,可以在步骤8之后收集暴露的苍蝇,以进行随后的基因组和代谢组学分析。然后可以按照Li和Tennessen47的描述,从步骤3开始处理在步骤8中收集的样品。
最终,从上述实验中获得的数据,以及任何随后的代谢组学和蛋白质组学数据,理想情况下将用于跨物种比较。如前所述,26,这种跨物种研究是强大的,能够确定单个化学物质如何干扰保守的生物途径。因此,上述协议可用于发现响应跨门的单个有毒物质的进化共性,并有助于为化学安全监管提供信息。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢我们的员工帮助测试和优化此协议:Ameya Belamkar,Marilyn Clark,Alexander Fitt,Emma Rose Gallant,Ethan Golditch,Matthew Lowe,Morgan Marsh,Kyle McClung,Andy Puga,Darcy Rose,Cameron Stockbridge和Noelle Zolman。我们还要感谢精准毒理学小组的同事,特别是我们的暴露小组同行,帮助确定了协议的目标。
该项目根据第965406号赠款协议获得了欧盟地平线2020研究与创新计划的资助。本出版物中介绍的工作是作为ASPIS集群的一部分进行的。本输出仅反映作者的观点,欧洲联盟不对其中所载信息的任何使用负责。该出版物也是在印第安纳州临床和转化科学研究所的支持下实现的,该研究所部分由美国国立卫生研究院,国家推进转化科学,临床和转化科学中心奖的第UL1TR002529号资助。内容完全由作者负责,并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。该项目的部分内容得到了印第安纳大学授予JRS和PhyloTox财团的资金支持。JMH和EMP得到了NIH对布卢明顿果蝇种群中心P40OD018537奖的支持。
1.5 inch flower lever action craft punch | Bira Craft | HCP-115-024 | |
15 mL Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL |
2 ml Tubes | VWR | 16466-044 | Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom |
5 ml Tubes | VWR | 60818-576 | Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430290 | 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap |
Benchmark Dose Software version 3.2 | U.S. Environmental Protection Agency | ||
Cardboard trays | Genesee Scientific flystuff | 32-122 | trays and dividers for narrow vials |
CO2 gas pads | Genesee Scientific flystuff | 59-114 | FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus |
Combitips advanced, 50 mL | Eppendorf | 0030089693 | Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips |
Cotton balls | Genesee Scientific flystuff | 51-101 | Cotton balls, large, fits narrow vials |
Delicate task wipes | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39" |
Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) | VWR | 89168-888 | Wide |
FD&C Blue No. 1 | Spectrum Chemical | FD110 | CAS number 3844-45-9 |
Flies | BDSC | Stock #2057 | OregonR wildtype |
Gloves (nitrile) | Kimtech | 55082/55081/55083 | Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" |
Grade 1 CHR cellulose chromatography paper | Cytvia | 3001-917 | Sheet, 46 x 57 cm |
Mesh for humidity chamber | |||
Multipette / Repeater (X) stream | Eppendorf | 022460811 | Repeater Xstream |
Plastic grate | Plaskolite | 18469 (from lowes) | Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs |
Plastic trays for glass vials | Genesee Scientific flystuff | 59-207 | Narrow fly vial reload tray |
Polypropylene Drosophila Vial | VWR | 75813-156 | Wide (28.5 mm) |
Rubbermaid tubs | Rubbermaid | 3769017 (from Lowes) | Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H |
Sucrose ultra pure | MP Biomedicals, Inc. | 821721 | |
Tube racks for wide-mouthed tubes | Thermo scientific | 5970-0230 | Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes |
Water Purification System | Millipore Milli-Q | ZMQ560F01 | Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier |
Yeast extract | Acros Organics | 451120050 | CAS number 84604-16-0 |