성인 Drosophila Melanogaster의 화학적 독성 평가
Summary
이 프로토콜은 액체 배지를 사용하여 성인 Drosophila melanogaster의 생존 가능성에 대한 화학 독성 물질의 영향을 평가하는 효율적이고 저렴한 방법을 설명합니다.
Abstract
인간 산업은 수십만 개의 화학 물질을 생성하며, 그 중 다수는 환경 안전이나 인체 건강에 미치는 영향에 대해 적절하게 연구되지 않았습니다. 이러한 화학 물질 안전 정보의 부족은 비용이 많이 들고 노동 집약적이며 시간이 많이 소요되는 포유류의 현재 테스트 방법으로 인해 악화됩니다. 최근 과학자들과 규제 당국은 더 저렴하고 신속하며 동물의 고통을 줄이는 화학 물질 안전 테스트를 위한 새로운 접근 방법론(NAM)을 개발하기 위해 노력하고 있습니다. 등장할 주요 NAM 중 하나는 인간을 포함하여 멀리 떨어진 관련 종에 걸쳐 보존된 화학적 작용 방식을 설명하기 위해 포유류 모델의 대체품으로 무척추 동물 유기체를 사용하는 것입니다. 이러한 노력을 진전시키기 위해 여기에서는 초파리인 Drosophila melanogaster를 사용하여 화학적 안전성을 평가하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 노출된 성충의 생존력과 섭식 행동을 측정하기 위한 간단하고 신속하며 저렴한 절차를 설명합니다. 또한 이 프로토콜은 게놈 및 대사체학 접근법을 위한 샘플을 생성하도록 쉽게 조정할 수 있습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 초파리 를 정밀 독성학에 사용하기 위한 표준 모델로 확립하는 데 중요한 진전을 나타냅니다.
Introduction
인간은 공기1, 식품2, 물3,4, 약물5, 세척제6, 퍼스널 케어 제품7, 산업용 화학물질7, 건축 자재7 등 다양한 출처의 화학물질에 지속적으로 노출되어 있다. 더욱이 매년 수천 가지의 새로운 화학물질이 유입되고 있으며8 이들 중 상당수는 보건 및 환경 안전에 대한 적절한 검증을 받지 못하고 있다. 이러한 적절한 화학 안전성 테스트의 부족은 부분적으로 생쥐 및 쥐와 같은 포유류 모델에 대한 과도한 의존에서 비롯됩니다. 이러한 설치류 모델은 유익한 정보를 제공하지만, 이러한 시스템에서의 화학적 안전성 테스트는 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되며, 종종 실험 동물에게 허용할 수 없는 수준의 고통을 초래한다9.
포유류 화학 물질 안전성 테스트와 관련된 재정적, 윤리적 부담과 포유류 연구의 시간 소모적 특성은 새로운 화학 물질을 둘러싼 데이터 부족에 기여하는 주요 요인입니다. 이 문제를 해결하기 위해 미국 환경보호국(EPA), 유럽화학물질청(ECHA), 캐나다 보건부(Health Canada) 및 기타 기관들은 새로운 접근 방법론(NAM)을 규제 프레임워크10에 통합하는 조치를 시행하고 있으며, 이에 따라 북미 및 유럽 정책을 동물 사용을 대체, 감소 및 개선하려는 국제적 목표(3R 원칙)에 부합하도록 하고 있습니다.11. 12,13,14. NAM은 주로 시험관 내 및 인실리코 모델을 기반으로 하는 다양한 분석을 포함하며, 이는 포유류 테스트 종에 가해지는 역경을 관찰하는 대신 화학적 독성에 대한 기계론적 이해를 제공하여 화학적 위험 평가를 위한 데이터 생성 속도를 높이는 동시에 높은 충실도의 출력을 생성합니다15. 그러나 이러한 방법은 기관 간 통신 및 내분비 신호 전달과 관련된 중요한 생물학적 과정의 중단을 포함하여 전신 독성으로부터 보호하는 것으로 아직 입증되지 않았습니다. 또한 특정 조직 내 화학 물질의 생물 축적, 개별 화합물의 흡수 및 분비 능력, 행동과 화학 물질 노출 간의 상호 작용을 설명 할 수 없습니다.
시험관 내 및 전산 모델의 한계로 인해 포유류 모델을 줄이거나 대체하기 위한 NAM의 성공적인 사용에는 초파리, 초파리 멜라노가스터와 같은 무척추동물 생체 내 모델도 포함되어야 합니다. 파리에 대한 이전 연구는이 유기체가 독성 분자 16,17,18,19,20,21,22로부터 동물 세포를 보호하는 보존 된 유전 경로를 연구하는 데 매우 적합하다는 것을 입증했습니다. 또한, 파리는 인간 질병의 65% 이상에 대한 기능적 상동체(23,24,25)와 중요한 기능적 경로의 훨씬 더 큰 보존을 포함하여 인간과 현저한 유전적 유사성을 보여줍니다 26. 이러한 특징은 상대적으로 짧은 수명주기, 낮은 유지 보수 비용 및 쉽게 관찰 가능한 행동 반응과 결합되어 Drosophila를 독성 모델로 사용하기에 매우 적합합니다27,28,29,30. 또한, 파리는 설치류 모델보다 처리량이 훨씬 높으며, 다른 비유기체 NAM으로는 쉽게 검출할 수 없는 대사, 생리학 및 호르몬 신호 전달 효과를 포착한다9.
여기에 설명된 프로토콜은 성인 초파리에 대한 화학 물질 노출의 영향을 테스트하기 위한 프레임워크를 나타냅니다. 이 방법은 효율적이고 저렴하며 재현 가능하도록 설계되었으며, 연구자가 테스트 화학 물질과 접촉해야 하는 시간을 최소화하고 대사체학 및 기타 오믹스 접근법을 위한 샘플 수집을 수용합니다. 이 프로토콜은 실험당 단일 화학 물질을 테스트하는 데 최적화되어 있지만 다양한 용매 또는 화학 물질 조합과 같은 다른 실험 파라미터를 쉽게 수용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
초파리 Drosophila melanogaster는 NAM16,18,19,21의 강력한 시스템으로 부상하고 있습니다. 유전체학 및 대사체학의 최근 발전과 결합된 파리 군집이 이용할 수 있는 비할 데 없는 유전 자원을 활용함으로써 초파리를 사용한 화학적 안전성 연구는 개별 화합물이 대사, 생리학 및 세포 신호 전달을 방해하는 분자 메커니즘을 신속하게 식별할 수 있습니다(예:39). 이 저렴한 프로토콜은 용량-반응 곡선을 신속하게 정의하고 이후에 RNA-seq 및 대사체학 분석을 위한 샘플을 생성하도록 설계되었습니다. 또한, 이 유연한 프로토콜은 모든 유전자형에 사용할 수 있으며 다양한 종류의 화학 물질을 수용할 수 있습니다.
이 프로토콜의 주목할만한 측면은 화학 물질 노출에 사용되는 액체 식품의 선택이며, 이는 이전 연구를 기반으로 하지만 Drosophila18,22에 대한 대부분의 독성학적 연구에서 사용되는 고체 배지와 다릅니다. 이 특정 액체 배지는 파리가 일관된 영양을 받을 수 있도록 하기 위해 파리도 이 프로토콜에서 먹이는 표준 고체 BDSC 배지의 영양 성분을 반영하도록 선택되었습니다. 액체 공급 매체의 단순성에는 많은 장점이 있습니다. 액체 매체는 용융 및 재응고 또는 분말로 재구성해야 하는 고체 식품보다 취급이 더 쉽습니다. 액체 매체는 또한 시스템의 처리량을 증가시키고, 공급 매체 전체에 균일한 화학 물질 분배를 보장하며, 유해 화합물 작업에 소요되는 시간을 줄입니다. 또한 매체는 용액을 가열할 필요가 없어 휘발성 테스트 화합물의 테스트를 용이하게 합니다. 마지막으로, 식품 용액에 포함된 성분이 상대적으로 적기 때문에 시험 화학 물질과 다른 식이 성분 사이에 바람직하지 않은 부반응이 최소화됩니다. 식품에 사용되는 효모도 비활성이어서 공급 매체의 반응성을 더욱 제한합니다. 그러나 이 방법은 발달 또는 유충 독성을 테스트하는 데 적합하지 않습니다.
프로토콜에 사용되는 재료 중 일부는 폴리프로필렌 대신 유리 플라이 바이알을 사용하는 것과 같이 대체될 수 있습니다. 그러나 사용된 재료는 유리 제품 세척으로 인해 발생할 수 있는 시약과 화학 물질 노출 사이의 원치 않는 화학 반응을 피하기 위해 불활성 및 일회용으로 선택되었습니다.
액체 식품을 사용하려면 음식 배달 차량이 필요합니다. 셀룰로오스 아세테이트 여과지는 유연성 및 불활성 성질 때문에 이러한 목적을 위해 선택되었다28. 다른 연구자들은 유사한 프로토콜을 사용했지만 섬세한 작업 물티슈 또는 유리 섬유 필터29,30과 같은 다른 차량과 함께 사용했습니다. 셀룰로오스 아세테이트 여과지는 종이와 바이알 벽 사이에 큰 간격 없이 플라이 바이알의 바닥에 맞도록 이상적인 모양으로 절단할 수 있는 불활성 비히클이기 때문에 이러한 요구에 적합하여 파리가 매체 또는 차량 자체에 끼어 사망하는 것을 방지합니다.
이 시스템의 중요한 한계는 화학 물질의 최대 테스트 가능한 농도가 화학 물질의 용해도와 관련이 있다는 것입니다. 비수용성 화합물은 추가 용매를 필요로 하며, 이는 관심 화학 물질과 추가 또는 시너지 효과를 유발할 수 있습니다. 이것은 또한 모든 유기체에서 원하는 종말점을 달성하기에 충분히 농축된 스톡 용액을 제조하는 것이 불가능한 상황을 생성할 수 있고, 따라서 결과 데이터(31)의 분석을 제한할 수 있다. 이를 해결하기 위해 수용성이 낮은 화학 물질은 식품 용액에 최대 0.5 %의 디메틸 설폭 사이드를 첨가하여 테스트 할 수 있습니다. 다른 용매도 사용할 수 있지만 유기체에 대한 용매 영향을 최소화하면서 용해도를 최대화하기 위해 용액 내 최대 허용 용매 농도를 결정하기 위해 관심 있는 각 용매에 대한 추가 연구가 필요합니다.
초파리(Drosophila)의 후각 반응에 대한 광범위한 특성화는 파리가 독성 화합물40,41을 섭취하는 것을 피하여 처리된 배지의 먹이를 줄이는 방법을 설명했습니다. 청색 염료 분석은 연구자들이 실험 화학 물질42,43,44의 각 농도를 먹인 파리의 섭식 행동을 효율적으로 스크리닝할 수 있도록 함으로써 이러한 현상을 해결합니다. 파리의 위장관에 파란색이 있는지 여부는 파리가 독성 물질 함유 배지를 먹었는지 여부를 나타냅니다. 플라이 리퀴드-푸드 상호작용 계수기(Fly Liquid-Food Interaction Counter45)와 같이 플라이 섭식 거동을 평가하는 보다 정교한 방법이 존재하지만, 이 정성적 방법은 고처리량 스크리닝에 더 적합합니다.
이 프로토콜의 주목할만한 측면은 파리를 옮기거나 노출 바이알에 추가 액체를 추가할 필요 없이 48시간 노출 기간 동안 최적화되었다는 것입니다. 습도 챔버를 사용하고 챔버를 높은 습도로 유지된 인큐베이터에 배치하면 이 기간 동안 공급 매체가 포함된 여과지가 건조되는 것을 방지할 수 있습니다. 이 프로토콜은 더 긴 노출 기간 동안 조정할 수 있지만 여과지가 건조해지지 않고 건조로 인해 용액 농도 또는 치사율에 상당한 변화를 일으키지 않도록 방법을 조정해야 합니다.
마지막으로, 이 프로토콜의 중요한 특징은 유전적 변이를 쉽게 수용할 수 있다는 것인데, 이를 통해 연구자들은 초파리 를 위한 방대한 유전 도구를 활용하여 야생형 유기체에 대한 이러한 예비 연구를 확장하여 생체 내 화학 작용 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다. 이와 관련하여, 위에서 설명한 프로토콜은 야생에서 잡은 파리의 독성학적 분석을 가능하게 하는 Peterson and Long에 의해 이전에 기술된 JoVE 프로토콜을 보완하기 위해 쉽게 수정될 수 있다18.
초파리 32,33,34,35,36에서 나트륨 비소의 독성에 대한 다양한 이전 연구로 인해 Oregon-R 파리는 우리 시스템의 효능을 입증하기 위해 이 화합물로 처리되었습니다. 수컷 파리는 0.65 mM의 LD50을 나타내었고, 암컷은 0.90 mM의LD50을 나타내었다. 이것은 나트륨 비소 처리 성인 초파리에 대한 이전 연구와 일치합니다. 예를 들어, Goldstein과 Babich37은 0.5mM NaAsO2에 7 일 동안 노출 된 후 파리 (혼합 성별)의 50 %가 사망 한 것을 발견했습니다. 이것은 현재 관찰된 것보다 약간 낮은 용량이지만, 그들의 방법과 이 방법의 차이(고체 노출 매체의 사용, 더 긴 시간 척도 및 혼합 성별 포함)가 이러한 차이를 설명할 가능성이 높습니다. 중요하게도, 두 방법 모두 전체적으로 유사한LD50 값을 초래하였다.
이 프로토콜을 사용한 실험의 관찰은 후속 행동 또는 기계론적 연구를 위한 유전 및 분자 표적을 찾는 데 사용할 수 있습니다. 노출 방법은 또한 대사체학 및 단백질체학을 위한 샘플링을 위해 초파리 를 처리하는 데 사용할 수 있으며, 이 프로토콜은 성장하는 정밀 독성학 분야(정밀 의학 분야46에서 모델링됨)에 매우 적합합니다. 이와 관련하여, 노출된 파리는 후속 게놈 및 대사체학 분석을 위해 단계 8 후에 수집될 수 있다. 8 단계에서 수집 된 샘플은 3 단계부터 시작하여 Li 및 Tennessen47에 의해 설명 된대로 처리 될 수 있습니다.
궁극적으로, 위에서 설명한 실험에서 얻은 데이터와 후속 대사체학 및 단백질체학 데이터는 종 간 비교에 이상적으로 사용될 것입니다. 앞서 언급한바와 같이26, 이러한 종간 연구는 강력하며 개별 화학 물질이 보존된 생물학적 경로를 어떻게 방해하는지 결정할 수 있습니다. 따라서 위에서 설명한 프로토콜은 문에 걸쳐 개별 독성 물질에 대한 반응으로 진화적 공통점을 찾고 화학 물질 안전 규정을 알리는 데 사용할 수 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로토콜의 테스트 및 최적화에 도움을 주신 Ameya Belamkar, Marilyn Clark, Alexander Fitt, Emma Rose Gallant, Ethan Golditch, Matthew Lowe, Morgan Marsh, Kyle McClung, Andy Puga, Darcy Rose, Cameron Stockbridge 및 Noelle Zolman에게 감사드립니다. 또한 프로토콜의 목표를 식별하는 데 도움을 준 Precision Toxicology Group의 동료, 특히 Exposure Group의 동료들에게도 감사드립니다.
이 프로젝트는 보조금 계약 번호 965406에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램으로부터 자금을 받았습니다. 이 간행물에 제시된 작업은 ASPIS 클러스터의 일부로 수행되었습니다. 이 출력물은 저자의 견해만을 반영하며 유럽 연합은 여기에 포함된 정보의 사용에 대해 책임을 지지 않습니다. 이 출판물은 또한 National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award의 Award Number UL1TR002529에 의해 부분적으로 자금을 지원받는 Indiana Clinical and Translational Sciences Institute의 지원으로 가능했습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 이 프로젝트의 일부는 JRS와 PhyloTox 컨소시엄에 수여 된 인디애나 대학의 기금으로 지원되었습니다. JMH와 EMP는 블루밍턴 초파리 스톡 센터(Bloomington Drosophila Stock Center)에 P40OD018537 NIH 어워드의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1.5 inch flower lever action craft punch | Bira Craft | HCP-115-024 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL |
| 2 ml Tubes | VWR | 16466-044 | Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom |
| 5 ml Tubes | VWR | 60818-576 | Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430290 | 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap |
| Benchmark Dose Software version 3.2 | U.S. Environmental Protection Agency | ||
| Cardboard trays | Genesee Scientific flystuff | 32-122 | trays and dividers for narrow vials |
| CO2 gas pads | Genesee Scientific flystuff | 59-114 | FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus |
| Combitips advanced, 50 mL | Eppendorf | 0030089693 | Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips |
| Cotton balls | Genesee Scientific flystuff | 51-101 | Cotton balls, large, fits narrow vials |
| Delicate task wipes | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39" |
| Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) | VWR | 89168-888 | Wide |
| FD&C Blue No. 1 | Spectrum Chemical | FD110 | CAS number 3844-45-9 |
| Flies | BDSC | Stock #2057 | OregonR wildtype |
| Gloves (nitrile) | Kimtech | 55082/55081/55083 | Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" |
| Grade 1 CHR cellulose chromatography paper | Cytvia | 3001-917 | Sheet, 46 x 57 cm |
| Mesh for humidity chamber | |||
| Multipette / Repeater (X) stream | Eppendorf | 022460811 | Repeater Xstream |
| Plastic grate | Plaskolite | 18469 (from lowes) | Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs |
| Plastic trays for glass vials | Genesee Scientific flystuff | 59-207 | Narrow fly vial reload tray |
| Polypropylene Drosophila Vial | VWR | 75813-156 | Wide (28.5 mm) |
| Rubbermaid tubs | Rubbermaid | 3769017 (from Lowes) | Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H |
| Sucrose ultra pure | MP Biomedicals, Inc. | 821721 | |
| Tube racks for wide-mouthed tubes | Thermo scientific | 5970-0230 | Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes |
| Water Purification System | Millipore Milli-Q | ZMQ560F01 | Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier |
| Yeast extract | Acros Organics | 451120050 | CAS number 84604-16-0 |
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