Summary

Un método de homogeneización rápido, simple y estandarizado para preparar emulsiones de antígeno/adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune experimental

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

Para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo animal de esclerosis múltiple, los ratones son inmunizados con una emulsión de agua en aceite que contiene un autoantígeno y un adyuvante completo de Freund. Si bien existen varios protocolos para la preparación de estas emulsiones, aquí se presenta un protocolo de homogeneización rápido, simple y estandarizado para la preparación de emulsiones.

Abstract

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) comparte características inmunológicas y clínicas similares con la esclerosis múltiple (EM) y, por lo tanto, se usa ampliamente como modelo para identificar nuevos objetivos farmacológicos para un mejor tratamiento del paciente. La EM se caracteriza por varios cursos diferentes de la enfermedad: EM recurrente-remitente (EMRR), EM progresiva primaria (EMPP), EM progresiva secundaria (EMSP) y una forma rara de EM progresiva-recurrente (EMPR). Aunque los modelos animales no imitan con precisión todos estos fenotipos contrastantes de enfermedades humanas, existen modelos EAE que reflejan algunas de las diferentes manifestaciones clínicas de la EM. Por ejemplo, la EAE inducida por la glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG) en ratones C57BL / 6J imita la EMPP humana, mientras que la EAE inducida por la proteína proteolípida de mielina (PLP) en ratones SJL / J se asemeja a RRMS. Otros autoantígenos, como la proteína básica de mielina (MBP), y una serie de cepas de ratón diferentes también se utilizan para estudiar la EAE. Para inducir la enfermedad en estos modelos EAE de autoinmunización con antígenos, se prepara una emulsión de agua en aceite y se inyecta por vía subcutánea. La mayoría de los modelos de EAE también requieren una inyección de toxina pertussis para que la enfermedad se desarrolle. Para una inducción EAE consistente y reproducible, es necesario un protocolo detallado para preparar los reactivos para producir emulsiones antígeno/adyuvantes. El método descrito aquí aprovecha un método estandarizado para generar emulsiones de agua en aceite. Es simple y rápido y utiliza un homogeneizador agitador en lugar de jeringas para preparar emulsiones de calidad controlada.

Introduction

Una ruptura de la tolerancia inmunológica puede resultar en la generación de trastornos autoinmunes, como la esclerosis múltiple (EM). Se estima que 2,8 millones de personas viven con EM en todo el mundo1. Aunque la causa exacta de la EM es todavía en gran parte desconocida, la desregulación de las células T y B autorreactivas, así como los defectos en la función Treg, juegan un papel importante en la patogénesis de la enfermedad 2,3.

Los modelos animales de enfermedades autoinmunes son herramientas esenciales para investigar posibles modalidades terapéuticas. El modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE) ha sido utilizado durante casi un siglo por investigadores interesados en la EM4. En los primeros experimentos, la incidencia de la enfermedad era relativamente baja. La introducción del adyuvante completo de Freund (CFA), que contiene Mycobacterium y toxina pertussis, permitió la inducción consistente de EAE en ratones4. Lo más importante es que es necesario mezclar CFA con un antígeno específico del sistema nervioso central (SNC) para generar una emulsión homogénea de agua en aceite para inducir EAE. Los modelos EAE más comunes actualmente disponibles se basan en la inmunización activa de ratones con péptidos encefalitogénicos. Los antecedentes genéticos de los ratones juegan un papel importante en la susceptibilidad a la enfermedad, con péptidos de glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG35-55) y proteína proteolípida de mielina (PLP139-151) utilizados para inducir EAE en ratones C57BL / 6J y SJL, respectivamente5. Sin embargo, también se pueden usar otras cepas de ratón y péptidos derivados del SNC.

La calidad de la emulsión CFA/péptido es un factor crítico que determina la penetrancia de la enfermedad en el modelo6 de inmunización activa EAE. Se debe preparar una emulsión homogénea de agua en aceite mezclando los péptidos encefalitogénicos disueltos en tampón acuoso con CFA, de lo contrario los animales no desarrollarán la enfermedad. Se han publicado numerosos protocolos sobre la preparación de emulsiones CFA/péptidos. Los ejemplos incluyen el uso de un vórtice7, sonicación8, jeringas y un conector T de tres vías9, o una jeringa solo5. Sin embargo, todos estos métodos son difíciles de estandarizar y a menudo se asocian con protocolos largos y complicados.

En comparación con todos los métodos anteriores, el método simple descrito aquí para la preparación de emulsiones ofrece las ventajas de no tener diferencias de persona a persona y ser relativamente rápido. La emulsión es generada por un homogeneizador que agita los reactivos con una velocidad, tiempo y temperatura establecidos, asegurando resultados rápidos y consistentes. Además de inducir enfermedad en el modelo EAE, este método también puede ser utilizado para estudiar otros modelos de enfermedades autoinmunes como la artritis inducida por colágeno (CIA) y la artritis inducida por antígenos (AIA)6. Por lo tanto, se anticipa que este método puede ser utilizado para inducir consistentemente la enfermedad en otros modelos animales que dependen de emulsiones de agua en aceite con autoantígenos, como la neuritis autoinmune experimental (EAN)10, la tiroiditis autoinmune experimental (EAT)11, la uveítis autoinmune (EAU)12 y la miastenia gravis (MG)13. Este método también induce respuestas inmunes generales, como la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) de manera consistente6, y por lo tanto podría usarse para administrar vacunas contra el cáncer y la malaria (ver discusión).

Por lo tanto, se ha desarrollado un método rápido (tiempo total de preparación ~ 30 min), simple (todos los reactivos se pueden preparar y almacenar) y estandarizado (la emulsión se logra utilizando un homogeneizador de agitación) y se presenta aquí. Las emulsiones CFA/antígeno preparadas utilizando este protocolo inducen consistentemente la enfermedad en modelos animales autoinmunes.

Protocol

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las prácticas de la Junta Sueca de Investigación Animal y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal, Lund-Malmö, Suecia (Número de permiso: M126-16). NOTA: En la figura 1 se describe un flujo esquemático del método. 1. Preparación del material NOTA: Preparar todos los reactivos asépticamente en una campana estéri…

Representative Results

El protocolo rápido, simple y estandarizado para la preparación de emulsiones CFA/MOG se muestra en la Figura 1. Este método ha sido descrito recientemente en otra parte6. Las emulsiones CFA/MOG también se pueden preparar con otros métodos, como el método tradicional de jeringa o por vórtice. Estos métodos se compararon aquí evaluando la calidad de las emulsiones. Todos los métodos produjeron emulsiones de agua en aceite; La homogeneidad y la calidad de esta…

Discussion

Las emulsiones de agua en aceite, como el antígeno/adyuvante de Freund, se han utilizado durante más de medio siglo para inducir EAE17. Actualmente no existe un método estandarizado para preparar emulsiones de antígenos que sea independiente de la influencia humana. La mezcla manual con jeringas es estándar para la mayoría de los laboratorios, sin embargo, este método lleva mucho tiempo, a menudo resulta en una pérdida excesiva de material y la calidad difiere según el científico que lo …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El autor desea agradecer a las unidades de alojamiento de animales de la Universidad de Lund, Camilla Björklöv y Agnieszka Czopek, por su apoyo, y a Richard Williams, del Instituto Kennedy de Reumatología, Universidad de Oxford, Reino Unido, por la crítica constructiva y el apoyo lingüístico que produce este manuscrito.

Materials

1 mL Injection syringe B. Braun 9166017V 
1 mL Injection syringe Sigma-Aldrich Z683531
7 ml empty tubes with caps Bertin-Instruments P000944LYSK0A.0 7 mL tube
50 mL sterile centrifuge tube  Fisher Scientific 10788561 50 mL tube
Bordetella pertussis toxin Sigma-Aldrich P2980 Store at -20 °C
Dispersant, light mineral oil Sigma-Aldrich M8410 Store at RT
Emulsion kit Bertin-Instruments D34200.10 ea Containing a tube, cap, and plunger
Incomplete Freund's Adjuvant Sigma-Aldrich  F5506 Store at +4 °C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA Fisher Scientific DF3114-33-8 Store at +4 °C
Mastersizer 2000  Malvern Panalytical N/A Particle size analyzer
Minilys-Personal homogenizer Bertin-Instruments P000673-MLYS0-A Shaking homogenizer
MOG 35-55 Peptide    Innovagen N/A
Montanide ISA 51 VG Seppic 36362Z FDA-approved oil adjuvant
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm Fisher Scientific 17124381 Sterlie filter
PBS, Ca2+/Mg2+ free Thermo Fisher Scientific 14190144 PBS
Phase-Constrast Microscope Olympus BX40-B
Steel Beads 3.2 mm Fisher Scientific NC0445832 Autoclave and store at RT
Triton X-100 Sigma-Aldrich 648463 Store at RT

References

  1. Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
  2. van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
  3. Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells’ Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
  4. Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis–potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
  5. Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
  6. Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
  7. Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
  8. Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
  9. Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
  10. Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
  11. Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
  12. Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , (2003).
  13. Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
  14. Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
  15. Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
  16. Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
  17. Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
  18. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
  19. Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
  20. Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
  21. Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
  22. Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).

Play Video

Cite This Article
Bäckström, B. T. A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (190), e64634, doi:10.3791/64634 (2022).

View Video