Summary

Een snelle, eenvoudige en gestandaardiseerde homogenisatiemethode om antigeen / adjuvante emulsies voor te bereiden voor het induceren van experimentele auto-immune encefalomyelitis

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

Om experimentele auto-immune encefalomyelitis, een diermodel van multiple sclerose, te induceren, worden muizen geïmmuniseerd met een water-in-olie-emulsie die een autoantigeen bevat en het adjuvans van Freund compleet maakt. Hoewel er verschillende protocollen bestaan voor de bereiding van deze emulsies, wordt hier een snel, eenvoudig en gestandaardiseerd homogenisatieprotocol voor emulsievoorbereiding gepresenteerd.

Abstract

Experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) deelt vergelijkbare immunologische en klinische kenmerken met multiple sclerose (MS) en wordt daarom veel gebruikt als model om nieuwe medicijndoelen te identificeren voor een betere behandeling van patiënten. MS wordt gekenmerkt door verschillende ziekteverloop: relapsing-remitting MS (RRMS), primaire progressieve MS (PPMS), secundair progressieve MS (SPMS) en een zeldzame progressief-recidiverende vorm van MS (PRMS). Hoewel diermodellen niet al deze contrasterende fenotypen van menselijke ziekten nauwkeurig nabootsen, zijn er EAE-modellen die enkele van de verschillende klinische manifestaties van MS weerspiegelen. Bijvoorbeeld, myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) -geïnduceerde EAE in C57BL / 6J-muizen bootst menselijke PPMS na, terwijl myeline proteolipide-eiwit (PLP) -geïnduceerde EAE in SJL / J-muizen lijkt op RRMS. Andere autoantigenen, zoals myeline basiseiwit (MBP), en een aantal verschillende muizenstammen worden ook gebruikt om EAE te bestuderen. Om ziekte te induceren in deze auto-antigeen-immunisatie EAE-modellen, wordt een water-in-olie-emulsie voorbereid en subcutaan geïnjecteerd. De meeste EAE-modellen vereisen ook een injectie van kinkhoesttoxine om de ziekte te ontwikkelen. Voor consistente en reproduceerbare EAE-inductie is een gedetailleerd protocol nodig om de reagentia voor te bereiden op de productie van antigeen/adjuvante emulsies. De hier beschreven methode maakt gebruik van een gestandaardiseerde methode om water-in-olie-emulsies te genereren. Het is eenvoudig en snel en gebruikt een schuddende homogenisator in plaats van spuiten om kwaliteitsgecontroleerde emulsies te bereiden.

Introduction

Een afbraak van immunologische tolerantie kan leiden tot het ontstaan van auto-immuunziekten, zoals multiple sclerose (MS). Naar schatting leven wereldwijd 2,8 miljoen mensen met MS1. Hoewel de exacte oorzaak van MS nog grotendeels onbekend is, spelen ontregeling van autoreactieve T- en B-cellen, evenals defecten in de Treg-functie, een belangrijke rol in de pathogenese van de ziekte 2,3.

Diermodellen van auto-immuunziekten zijn essentiële hulpmiddelen om potentiële therapeutische modaliteiten te onderzoeken. Het experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) model wordt al bijna een eeuw gebruikt door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in MS4. In vroege experimenten was de incidentie van de ziekte relatief laag. De introductie van complete Freund’s adjuvans (CFA), dat Mycobacterium en kinkhoesttoxine bevat, maakte de consistente inductie van EAE bij muizen4 mogelijk. Het belangrijkste is dat het noodzakelijk is om CFA te mengen met een centraal zenuwstelsel (CZS) -specifiek antigeen om een homogene water-in-olie-emulsie te genereren voor het induceren van EAE. De meest voorkomende momenteel beschikbare EAE-modellen zijn gebaseerd op de actieve immunisatie van muizen met encefanietgene peptiden. De genetische achtergrond van de muizen speelt een belangrijke rol bij ziektegevoeligheid, met myeline oligodendrocytenglycoproteïne (MOG35-55) en myeline proteolipide-eiwit (PLP139-151) peptiden die worden gebruikt om EAE te induceren in respectievelijk C57BL / 6J- en SJL-muizen, respectievelijk5. Andere muizenstammen en van het CZS afgeleide peptiden kunnen echter ook worden gebruikt.

De kwaliteit van de CFA/peptide-emulsie is een kritische factor die de penetrantie van de ziekte bepaalt in het actieve immunisatie EAE-model6. Een homogene water-in-olie-emulsie moet worden bereid door de encefanietgene peptiden opgelost in waterige buffer te mengen met CFA, anders zullen dieren de ziekte niet ontwikkelen. Er zijn tal van protocollen gepubliceerd over de bereiding van CFA/peptide-emulsies. Voorbeelden zijn het gebruik van een vortex7, ultrasoonapparaat8, spuiten en een drieweg T-connector9, of slechts één spuit5. Al deze methoden zijn echter moeilijk te standaardiseren en worden vaak geassocieerd met langdurige en gecompliceerde protocollen.

In vergelijking met alle bovenstaande methoden biedt de eenvoudige methode die hier wordt beschreven voor emulsiebereiding de voordelen van het hebben van geen verschillen van persoon tot persoon en relatief snel zijn. De emulsie wordt gegenereerd door een homogenisator die de reagentia schudt met een ingestelde snelheid, tijd en temperatuur, wat zorgt voor snelle en consistente resultaten. Naast het induceren van ziekte in het EAE-model, kan deze methode ook worden gebruikt om andere auto-immuunziektemodellen te bestuderen, zoals collageen-geïnduceerde artritis (CIA) en antigeen geïnduceerde artritis (AIA)6. Daarom wordt verwacht dat deze methode kan worden gebruikt om consequent ziekte te induceren in andere diermodellen die afhankelijk zijn van water-in-olie-emulsies met autoantigenen, zoals experimentele auto-immuunneuritis (EAN) 10, experimentele auto-immune thyroiditis (EAT) 11, auto-immuun uveïtis (EAU) 12 en myasthenia gravis (MG) 13. Deze methode induceert ook algemene immuunresponsen zoals vertraagde overgevoeligheid (DTH) consistent6, en kan daarom worden gebruikt voor het leveren van kanker- en malariavaccins (zie discussie).

Zo is een snelle (totale bereidingstijd ~ 30 min), eenvoudige (alle reagentia kunnen van tevoren worden bereid en opgeslagen) en gestandaardiseerde (de emulsie wordt bereikt met behulp van een schudhomogenisator) methode ontwikkeld en hier gepresenteerd. De CFA/antigeen emulsies bereid met behulp van dit protocol induceren consequent ziekte in auto-immuun diermodellen.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de praktijken van de Zweedse Raad voor Dieronderzoek en werden goedgekeurd door de Commissie Voor Dierenethiek, Lund-Malmö, Zweden (Vergunningsnummer: M126-16). OPMERKING: Een schematische stroom van de methode wordt beschreven in figuur 1. 1. Materiaalvoorbereiding OPMERKING: Bereid alle reagentia aseptisch in een steriele kap en bewaar ze bij de …

Representative Results

Het snelle, eenvoudige en gestandaardiseerde protocol voor de bereiding van CFA/MOG-emulsies is weergegeven in figuur 1. Deze methode is onlangs elders beschreven6. De CFA/MOG emulsies kunnen ook worden bereid met andere methoden, zoals de traditionele spuitmethode of door vortexing. Deze methoden werden hier vergeleken door de kwaliteit van de emulsies te beoordelen. Alle methoden produceerden water-in-olie-emulsies; de homogeniteit en kwaliteit van deze emulsies wer…

Discussion

Water-in-olie-emulsies, zoals antigeen /Freund’s adjuvans, worden al meer dan een halve eeuw gebruikt om EAE17 te induceren. Er is momenteel geen gestandaardiseerde methode om antigeenemulsies te bereiden die onafhankelijk is van menselijke invloed. Handmatig mengen met spuiten is standaard voor de meeste laboratoria, maar deze methode is tijdrovend, resulteert vaak in een overmatig verlies van materiaal en de kwaliteit verschilt afhankelijk van de wetenschapper die het bereidt.

<p class="jove…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteur wil graag de dierenverblijven van de Universiteit van Lund, Camilla Björklöv en Agnieszka Czopek, bedanken voor hun steun, en Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, VK, voor constructieve kritiek en taalkundige ondersteuning bij het produceren van dit manuscript.

Materials

1 mL Injection syringe B. Braun 9166017V 
1 mL Injection syringe Sigma-Aldrich Z683531
7 ml empty tubes with caps Bertin-Instruments P000944LYSK0A.0 7 mL tube
50 mL sterile centrifuge tube  Fisher Scientific 10788561 50 mL tube
Bordetella pertussis toxin Sigma-Aldrich P2980 Store at -20 °C
Dispersant, light mineral oil Sigma-Aldrich M8410 Store at RT
Emulsion kit Bertin-Instruments D34200.10 ea Containing a tube, cap, and plunger
Incomplete Freund's Adjuvant Sigma-Aldrich  F5506 Store at +4 °C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA Fisher Scientific DF3114-33-8 Store at +4 °C
Mastersizer 2000  Malvern Panalytical N/A Particle size analyzer
Minilys-Personal homogenizer Bertin-Instruments P000673-MLYS0-A Shaking homogenizer
MOG 35-55 Peptide    Innovagen N/A
Montanide ISA 51 VG Seppic 36362Z FDA-approved oil adjuvant
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm Fisher Scientific 17124381 Sterlie filter
PBS, Ca2+/Mg2+ free Thermo Fisher Scientific 14190144 PBS
Phase-Constrast Microscope Olympus BX40-B
Steel Beads 3.2 mm Fisher Scientific NC0445832 Autoclave and store at RT
Triton X-100 Sigma-Aldrich 648463 Store at RT

References

  1. Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
  2. van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
  3. Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells’ Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
  4. Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis–potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
  5. Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
  6. Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
  7. Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
  8. Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
  9. Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
  10. Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
  11. Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
  12. Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , (2003).
  13. Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
  14. Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
  15. Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
  16. Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
  17. Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
  18. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
  19. Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
  20. Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
  21. Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
  22. Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).

Play Video

Cite This Article
Bäckström, B. T. A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (190), e64634, doi:10.3791/64634 (2022).

View Video