Procédé d’homogénéisation rapide, simple et normalisé pour préparer des émulsions antigènes/adjuvants pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale
Summary
Pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal de sclérose en plaques, les souris sont immunisées avec une émulsion eau dans huile contenant un autoantigène et un adjuvant de Freund complet. Bien qu’il existe plusieurs protocoles pour la préparation de ces émulsions, un protocole d’homogénéisation rapide, simple et standardisé pour la préparation de l’émulsion est présenté ici.
Abstract
L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) partage des caractéristiques immunologiques et cliniques similaires à celles de la sclérose en plaques (SEP) et est donc largement utilisée comme modèle pour identifier de nouvelles cibles médicamenteuses pour un meilleur traitement des patients. La SEP se caractérise par plusieurs évolutions différentes de la maladie : la SEP cyclique (SEP-RR), la SEP progressive primaire (SPPP), la SEP progressive secondaire (SEP-SP) et une forme rare de SEP progressive-récurrente (SEP-PR). Bien que les modèles animaux n’imitent pas avec précision tous ces phénotypes de maladies humaines contrastées, il existe des modèles EAE qui reflètent certaines des différentes manifestations cliniques de la SEP. Par exemple, l’EAE induite par la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) chez les souris C57BL/6J imite la SPPP humaine, tandis que l’EAE induite par la protéine protéolipide de myéline (PLP) chez les souris SJL/J ressemble à la SEP-RR. D’autres autoantigènes, tels que la protéine basique de myéline (MBP), et un certain nombre de souches de souris différentes sont également utilisés pour étudier EAE. Pour induire la maladie dans ces modèles EAE d’auto-immunisation antigène, une émulsion eau dans huile est préparée et injectée par voie sous-cutanée. La majorité des modèles EAE nécessitent également une injection de toxine de la coqueluche pour que la maladie se développe. Pour une induction EAE cohérente et reproductible, un protocole détaillé pour préparer les réactifs à produire des émulsions antigènes/adjuvants est nécessaire. La méthode décrite ici tire parti d’une méthode standardisée pour générer des émulsions eau dans huile. Il est simple et rapide et utilise un homogénéisateur à agitation au lieu de seringues pour préparer des émulsions de qualité contrôlée.
Introduction
Une rupture de la tolérance immunologique peut entraîner la génération de maladies auto-immunes, telles que la sclérose en plaques (SEP). On estime que 2,8 millions de personnes vivent avec la SEP dans le monde1. Bien que la cause exacte de la SEP soit encore largement inconnue, la dérégulation des cellules T et B autoréactives, ainsi que les défauts de la fonction Treg, jouent un rôle important dans la pathogenèse de la maladie 2,3.
Les modèles animaux de maladies auto-immunes sont des outils essentiels pour étudier les modalités thérapeutiques potentielles. Le modèle expérimental d’encéphalomyélite auto-immune (EAE) est utilisé depuis près d’un siècle par les chercheurs qui s’intéressent à la SEP4. Dans les premières expériences, l’incidence de la maladie était relativement faible. L’introduction de l’adjuvant de Freund complet (CFA), contenant Mycobacterium et la toxine de la coqueluche, a permis l’induction constante de l’EAE chez la souris4. Plus important encore, il est nécessaire de mélanger le CFA avec un antigène spécifique du système nerveux central (SNC) pour générer une émulsion homogène eau dans huile pour induire EAE. Les modèles EAE les plus courants actuellement disponibles sont basés sur l’immunisation active de souris avec des peptides encéphalitogènes. Le fond génétique des souris joue un rôle important dans la susceptibilité à la maladie, avec les peptides de la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG35-55) et de la protéine protéolipide de myéline (PLP139-151) utilisés pour induire EAE chez les souris C57BL / 6J et SJL, respectivement5. Cependant, d’autres souches de souris et des peptides dérivés du SNC peuvent également être utilisés.
La qualité de l’émulsion CFA/peptide est un facteur critique qui détermine la pénétrance de la maladie dans l’immunisation active EAE modèle6. Une émulsion homogène eau dans huile doit être préparée en mélangeant les peptides encéphalitogènes dissous dans un tampon aqueux avec du CFA, sinon les animaux ne développeront pas la maladie. De nombreux protocoles ont été publiés sur la préparation des émulsions CFA/peptides. Les exemples incluent l’utilisation d’un vortex7, de la sonication8, de seringues et d’un connecteur T à trois voies9, ou d’une seringue seulement5. Cependant, toutes ces méthodes sont difficiles à normaliser et sont souvent associées à des protocoles longs et compliqués.
Par rapport à toutes les méthodes ci-dessus, la méthode simple décrite ici pour la préparation de l’émulsion offre les avantages de ne pas avoir de différences de personne à personne et d’être relativement rapide. L’émulsion est générée par un homogénéisateur secouant les réactifs avec une vitesse, un temps et une température définis, assurant des résultats rapides et cohérents. En plus d’induire la maladie dans le modèle EAE, cette méthode peut également être utilisée pour étudier d’autres modèles de maladies auto-immunes telles que l’arthrite induite par le collagène (ICA) et l’arthrite induite par l’antigène (AIA)6. Par conséquent, on s’attend à ce que cette méthode puisse être utilisée pour induire systématiquement la maladie dans d’autres modèles animaux qui dépendent d’émulsions eau-dans-huile avec des autoantigènes, tels que la névrite auto-immune expérimentale (EAN)10, la thyroïdite auto-immune expérimentale (EAT)11, l’uvéite auto-immune (EAU)12 et la myasthénie grave (MG)13. Cette méthode induit également des réponses immunitaires générales telles que l’hypersensibilité de type retardé (DTH) de manière constante6, et pourrait donc être utilisée pour administrer des vaccins anticancéreux et antipaludiques (voir discussion).
Ainsi, une méthode rapide (temps de préparation total ~30 min), simple (tous les réactifs peuvent être préparés à l’avance et stockés) et standardisée (l’émulsion est réalisée à l’aide d’un homogénéisateur agité) a été développée et est présentée ici. Les émulsions CFA/antigène préparées à l’aide de ce protocole induisent systématiquement la maladie dans des modèles animaux auto-immuns.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les émulsions eau-dans-huile, telles que l’antigène/adjuvant de Freund, sont utilisées depuis plus d’un demi-siècle pour induire EAE17. Il n’existe actuellement aucune méthode normalisée pour préparer des émulsions d’antigènes indépendante de l’influence humaine. Le mélange manuel à l’aide de seringues est standard pour la plupart des laboratoires, mais cette méthode prend du temps, entraîne souvent une perte excessive de matériel et la qualité diffère selon le scienti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’auteur tient à remercier les unités de logement des animaux de l’Université de Lund, Camilla Björklöv et Agnieszka Czopek, pour leur soutien, ainsi que Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, Université d’Oxford, Royaume-Uni, pour la critique constructive et le soutien linguistique qui ont produit ce manuscrit.
Materials
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
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