Summary

Um método de homogeneização rápido, simples e padronizado para preparar emulsões de antígenos/adjuvantes para induzir encefalomielite autoimune experimental

Published: December 09, 2022
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Summary

Para induzir encefalomielite autoimune experimental, um modelo animal de esclerose múltipla, os ratos são imunizados com uma emulsão de água em óleo contendo um autoantígeno e adjuvante completo de Freund. Embora existam vários protocolos para a preparação dessas emulsões, um protocolo de homogeneização rápido, simples e padronizado para a preparação de emulsões é apresentado aqui.

Abstract

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) compartilha características imunológicas e clínicas semelhantes com a esclerose múltipla (EM) e, portanto, é amplamente utilizada como modelo para identificar novos alvos de medicamentos para um melhor tratamento do paciente. A EM é caracterizada por vários cursos diferentes da doença: EM remitente-recorrente (EMRR), EM progressiva primária (EMPP), EM progressiva secundária (EMSP) e uma forma rara de EM progressiva-recidivante (EMPR). Embora os modelos animais não imitem com precisão todos esses fenótipos contrastantes de doenças humanas, existem modelos EAE que refletem algumas das diferentes manifestações clínicas da EM. Por exemplo, o EAE induzido por glicoproteína oligodendrócitos de mielina (MOG) em camundongos C57BL/6J imita PPMS humanos, enquanto o EAE induzido por proteína proteolipídica (PLP) de mielina em camundongos SJL/J se assemelha ao RRMS. Outros autoantígenos, como a proteína básica de mielina (MBP) e várias cepas diferentes de camundongos também são usados para estudar EAE. Para induzir a doença nesses modelos EAE de imunização de autoantígenos, uma emulsão de água em óleo é preparada e injetada por via subcutânea. A maioria dos modelos EAE também requer uma injeção de toxina pertussis para que a doença se desenvolva. Para uma indução consistente e reprodutível de EAE, é necessário um protocolo detalhado para preparar os reagentes para produzir emulsões de antígeno/adjuvante. O método descrito aqui aproveita um método padronizado para gerar emulsões de água em óleo. É simples e rápido e usa um homogeneizador de agitação em vez de seringas para preparar emulsões de qualidade controlada.

Introduction

Uma quebra da tolerância imunológica pode resultar na geração de distúrbios autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). Estima-se que 2,8 milhões de pessoas vivam com EM em todo o mundo1. Embora a causa exata da SM ainda seja amplamente desconhecida, a desregulação das células T e B auto-reativas, bem como defeitos na função Treg, desempenham papéis importantes na patogênese da doença 2,3.

Modelos animais de doenças autoimunes são ferramentas essenciais para investigar possíveis modalidades terapêuticas. O modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE) tem sido usado por quase um século por pesquisadores interessados na EM4. Nos primeiros experimentos, a incidência da doença era relativamente baixa. A introdução do adjuvante de Freund completo (CFA), contendo Mycobacterium e toxina pertussis, possibilitou a indução consistente de EAE em camundongos4. Mais importante ainda, é necessário misturar CFA com um antígeno específico do sistema nervoso central (SNC) para gerar uma emulsão homogênea de água em óleo para induzir EAE. Os modelos de EAE mais comuns atualmente disponíveis são baseados na imunização ativa de camundongos com peptídeos encefalitogênicos. O fundo genético dos camundongos desempenha um papel importante na suscetibilidade à doença, com peptídeos glicoproteína oligodendrócitos de mielina (MOG35-55) e proteína proteolipídica de mielina (PLP139-151) usados para induzir EAE em camundongos C57BL/6J e SJL, respectivamente5. No entanto, outras cepas de camundongos e peptídeos derivados do SNC também podem ser usados.

A qualidade da emulsão CFA/peptídeo é um fator crítico que determina a penetrância da doença no modelo 6 de imunização ativaEAE. Uma emulsão homogênea de água em óleo deve ser preparada misturando os peptídeos encefalitogênicos dissolvidos em tampão aquoso com CFA, caso contrário, os animais não desenvolverão a doença. Numerosos protocolos foram publicados sobre a preparação de emulsões CFA/peptídicas. Exemplos incluem o uso de um vórtice7, sonicação8, seringas e um conector T de três vias9, ou uma seringa apenas5. No entanto, todos esses métodos são difíceis de padronizar e são frequentemente associados a protocolos longos e complicados.

Em comparação com todos os métodos acima, o método simples descrito aqui para a preparação da emulsão oferece as vantagens de não ter diferenças de pessoa para pessoa e ser relativamente rápido. A emulsão é gerada por um homogeneizador agitando os reagentes com uma velocidade, tempo e temperatura definidos, garantindo resultados rápidos e consistentes. Além de induzir a doença no modelo EAE, esse método também pode ser utilizado para estudar outros modelos de doenças autoimunes, como a artrite induzida por colágeno (CIA) e a artrite induzida por antígeno (AIA)6. Portanto, espera-se que esse método possa ser utilizado para induzir consistentemente a doença em outros modelos animais que dependem de emulsões de água em óleo com autoantígenos, como neurite autoimune experimental (EAN)10, tireoidite autoimune experimental (EAT)11, uveíte autoimune (EAU)12 e miastenia gravis (MG)13. Esse método também induz respostas imunes gerais, como hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) de forma consistente6 e, portanto, poderia ser usado para administrar vacinas contra câncer e malária (ver discussão).

Assim, um método rápido (tempo total de preparação ~ 30 min), simples (todos os reagentes podem ser preparados com antecedência e armazenados) e padronizado (a emulsão é realizada usando um homogeneizador de agitação) foi desenvolvido e é apresentado aqui. As emulsões CFA/antígeno preparadas usando este protocolo induzem consistentemente a doença em modelos animais autoimunes.

Protocol

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as práticas do Conselho Sueco de Pesquisa Animal e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal de Lund-Malmö, Suécia (número de permissão: M126-16). Observação : um fluxo esquemático do método é descrito na Figura 1. 1. Preparação do material NOTA: Preparar todos os reagentes assepticamente num exaustor estéril, al?…

Representative Results

O protocolo rápido, simples e padronizado para a preparação de emulsões CFA/MOG está representado na Figura 1. Este método foi recentemente descrito em outro lugar6. As emulsões CFA/MOG também podem ser preparadas com outros métodos, como o método tradicional da seringa ou por vórtice. Esses métodos foram comparados aqui avaliando a qualidade das emulsões. Todos os métodos produziram emulsões de água em óleo; a homogeneidade e a qualidade dessas emuls…

Discussion

Emulsões de água em óleo, como o antígeno/adjuvante de Freund, têm sido usadas por mais de meio século para induzir EAE17. Atualmente, não existe um método padronizado para preparar emulsões de antígenos que seja independente da influência humana. A mistura manual usando seringas é padrão para a maioria dos laboratórios, no entanto, este método é demorado, muitas vezes resulta em uma perda excessiva de material, e a qualidade difere dependendo do cientista que o prepara.

<p cla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O autor gostaria de agradecer às unidades de alojamento de animais da Universidade de Lund, Camilla Björklöv e Agnieszka Czopek, por seu apoio, e Richard Williams, do Instituto Kennedy de Reumatologia, Universidade de Oxford, Reino Unido, pela crítica construtiva e apoio linguístico na produção deste manuscrito.

Materials

1 mL Injection syringe B. Braun 9166017V 
1 mL Injection syringe Sigma-Aldrich Z683531
7 ml empty tubes with caps Bertin-Instruments P000944LYSK0A.0 7 mL tube
50 mL sterile centrifuge tube  Fisher Scientific 10788561 50 mL tube
Bordetella pertussis toxin Sigma-Aldrich P2980 Store at -20 °C
Dispersant, light mineral oil Sigma-Aldrich M8410 Store at RT
Emulsion kit Bertin-Instruments D34200.10 ea Containing a tube, cap, and plunger
Incomplete Freund's Adjuvant Sigma-Aldrich  F5506 Store at +4 °C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA Fisher Scientific DF3114-33-8 Store at +4 °C
Mastersizer 2000  Malvern Panalytical N/A Particle size analyzer
Minilys-Personal homogenizer Bertin-Instruments P000673-MLYS0-A Shaking homogenizer
MOG 35-55 Peptide    Innovagen N/A
Montanide ISA 51 VG Seppic 36362Z FDA-approved oil adjuvant
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm Fisher Scientific 17124381 Sterlie filter
PBS, Ca2+/Mg2+ free Thermo Fisher Scientific 14190144 PBS
Phase-Constrast Microscope Olympus BX40-B
Steel Beads 3.2 mm Fisher Scientific NC0445832 Autoclave and store at RT
Triton X-100 Sigma-Aldrich 648463 Store at RT

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Cite This Article
Bäckström, B. T. A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (190), e64634, doi:10.3791/64634 (2022).

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