실험적 자가면역 뇌척수염 유도를 위한 항원/보조 에멀젼을 제조하기 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 방법
Summary
다발성 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하기 위해, 마우스를 자가항원 및 완전한 프로인트 보조제를 함유하는 유중수 에멀젼으로 면역화시킨다. 이러한 에멀젼의 제조를 위한 여러 프로토콜이 존재하지만, 에멀젼 제조를 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 프로토콜이 여기에 제시된다.
Abstract
실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)과 유사한 면역학적 및 임상적 특징을 공유하므로 더 나은 환자 치료를 위한 신약 표적을 식별하는 모델로 널리 사용됩니다. MS는 재발성 완화 MS (RRMS), 원발성 진행성 MS (PPMS), 이차성 진행성 MS (SPMS) 및 희귀 진행성 재발 형태의 MS (PRMS)와 같은 여러 가지 질병 과정을 특징으로합니다. 동물 모델이 이러한 대조적인 인간 질병 표현형을 모두 정확하게 모방하지는 않지만, MS의 상이한 임상 증상 중 일부를 반영하는 EAE 모델이 있다. 예를 들어, C57BL/6J 마우스에서 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG) 유도 EAE는 인간 PPMS를 모방하는 반면, SJL/J 마우스에서 미엘린 프로테오리피드 단백질(PLP) 유도 EAE는 RRMS와 유사합니다. 다른 자가항원, 예컨대 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 및 다수의 상이한 마우스 균주도 EAE를 연구하는데 사용된다. 이들 자가항원-면역화 EAE 모델에서 질환을 유도하기 위해, 유중수 에멀젼을 제조하고 피하 주사한다. EAE 모델의 대부분은 또한 질병이 발병하기 위해 백일해 독소의 주사를 필요로합니다. 일관되고 재현 가능한 EAE 유도를 위해서는 항원/보조 에멀젼을 생성하기 위한 시약을 준비하기 위한 상세한 프로토콜이 필요합니다. 여기에 설명된 방법은 표준화된 방법을 활용하여 유중수 에멀젼을 생성합니다. 간단하고 빠르며 주사기 대신 흔들리는 균질화기를 사용하여 품질 관리 에멀젼을 준비합니다.
Introduction
면역 학적 내성의 붕괴는 다발성 경화증 (MS)과 같은자가 면역 질환의 생성을 초래할 수 있습니다. 전 세계적으로 280만 명이 MS를 앓고 있는 것으로 추정됩니다1. MS의 정확한 원인은 아직 잘 알려져 있지 않지만자가 반응성 T 및 B 세포의 조절 장애와 Treg 기능의 결함은 질병의 발병 기전에 중요한 역할을합니다 2,3.
자가면역 질환의 동물 모델은 잠재적인 치료 양식을 조사하는 데 필수적인 도구입니다. 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델은 MS4에 관심이 있는 연구자들에 의해 거의 한 세기 동안 사용되어 왔다. 초기 실험에서이 질병의 발병률은 상대적으로 낮았습니다. 마이코박테리움 및 백일해 독소를 함유하는 완전한 프로인트 보조제(CFA)의 도입은 마우스4에서 EAE의 일관된 유도를 가능하게 하였다. 가장 중요한 것은 EAE를 유도하기 위한 균일한 유중수 에멀젼을 생성하기 위해 CFA를 중추신경계(CNS) 특이적 항원과 혼합하는 것이 필요하다는 것입니다. 현재 이용 가능한 가장 일반적인 EAE 모델은 뇌염 펩티드를 사용한 마우스의 활성 면역화에 기초한다. 마우스의 유전 적 배경은 각각 C57BL / 6J 및 SJL 마우스에서 EAE를 유도하기 위해 사용되는 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (MOG35-55) 및 미엘린 프로테오리피드 단백질 (PLP139-151) 펩타이드와 함께 질병 감수성에 중요한 역할을합니다5. 그러나, 다른 마우스 균주 및 CNS-유래된 펩티드가 또한 사용될 수 있다.
CFA/펩타이드 에멀젼의 품질은 활성 면역화 EAE 모델6에서 질병 침투를 결정하는 중요한 요소입니다. 균질 한 유중수 에멀젼은 수성 완충액에 용해 된 뇌염 생성 펩타이드를 CFA와 혼합하여 준비해야하며, 그렇지 않으면 동물이 질병을 발병하지 않습니다. CFA/펩타이드 에멀젼의 제조에 대한 수많은 프로토콜이 발표되었습니다. 예로는 와류7, 초음파 처리8, 주사기 및 3 방향 T 커넥터9, 또는 하나의 주사기만 5의 사용이 포함됩니다. 그러나 이러한 모든 방법은 표준화하기 어렵고 종종 길고 복잡한 프로토콜과 관련이 있습니다.
위의 모든 방법과 비교하여 에멀젼 제조를 위해 여기에 설명된 간단한 방법은 사람 대 사람 차이가 없고 상대적으로 빠르다는 이점을 제공합니다. 에멀젼은 설정된 속도, 시간 및 온도로 시약을 흔드는 균질화기에 의해 생성되어 빠르고 일관된 결과를 보장합니다. EAE 모델에서 질병을 유도하는 것 외에도이 방법은 콜라겐 유도 관절염 (CIA) 및 항원 유발 관절염 (AIA)과 같은 다른자가 면역 질환 모델을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다6. 따라서, 이 방법은 실험적 자가면역 신경염(EAN)10, 실험적 자가면역 갑상선염(EAT)11, 자가면역 포도막염(EAU)12 및 중증 근무력증(MG)13과 같은 자가항원이 있는 유중수 에멀젼에 의존하는 다른 동물 모델에서 질병을 일관되게 유도하는 데 사용될 수 있을 것으로 예상된다. 이 방법은 또한 지연형 과민증(DTH)과 같은 일반적인 면역 반응을 일관되게 유도합니다.6, 따라서 암 및 말라리아 백신을 전달하는 데 사용할 수 있습니다(토론 참조).
따라서, 신속한(총 준비 시간 ~30분), 단순(모든 시약은 미리 제조 및 저장될 수 있음) 및 표준화된(에멀젼은 진탕 균질기를 사용하여 달성됨) 방법이 개발되어 여기에 제시된다. 이 프로토콜을 사용하여 제조된 CFA/항원 에멀젼은 자가면역 동물 모델에서 일관되게 질병을 유도합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
항원/프로인트 보조제와 같은 유중수 에멀젼은 EAE17을 유도하기 위해 반세기 이상 사용되어 왔습니다. 현재 인간의 영향과 무관한 항원 에멀젼을 제조하는 표준화된 방법은 없습니다. 주사기를 사용한 수동 혼합은 대부분의 실험실에서 표준이지만이 방법은 시간이 많이 걸리고 종종 과도한 재료 손실을 초래하며 품질은 준비하는 과학자에 따라 다릅니다.
?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 룬드 대학교의 동물 주택 유닛인 카밀라 비외르클뢰프와 아그니에슈카 초펙의 지원과 영국 옥스퍼드 대학교 케네디 류마티스 연구소의 리처드 윌리엄스가 이 원고를 제작한 건설적인 비평과 언어적 지원에 대해 감사를 표하고 싶습니다.
Materials
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
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