Obtención de imágenes de la migración de neutrófilos en la piel del ratón para investigar la remodelación de la membrana subcelular en condiciones fisiológicas

Todos los experimentos y procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional del Cáncer (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.) (protocolos LCMB-031 y LCMB-035) y cumplieron con todas las regulaciones éticas relevantes. Para los experimentos se utilizaron ratones machos y hembras de entre 2 y 6 meses de edad. Los ratones huéspedes mT/mG y de tipo salvaje (WT) están en un fondo FVB/NJ, mientras que los ratones LyzM-Cre x mTmG están en un fondo C57BL/6. 1. Materiales y preparación de reactivos y herramientas Cubra tubos, platos y agujas/jeringas con PBS + 1% BSA (sin calcio y magnesio) durante la noche bajo agitación. Limpie cuidadosamente las superficies y las herramientas/instrumentos que se van a utilizar para el trabajo con animales utilizando etanol al 70% o esterilizándolo en autoclave.Para la purificación de neutrófilos, prepare lo siguiente: 3 tubos de 15 ml, 1 plato de 60 mm, 1 tubo de 1,5 ml; HBSS que contiene 10 mM HEPES (pH 7,3); solución de lisis de glóbulos rojos (ACK); Histopaco 1077; e Histopaque 1119. Para las inyecciones de neutrófilos, prepare lo siguiente: 1 jeringa de bajo volumen (10 μL), 1 aguja biselada de 33 G, isoflurano y solución anestésica (ketamina, xilacina y acepromazina a 80 mg·kg-1, 2 mg·kg-1 y 4 mg·kg-1, respectivamente, en solución salina). 2. Purificación de neutrófilos a partir de un ratón donante Sacrificar al ratón donante de acuerdo con las regulaciones institucionales locales. Recoja los huesos largos del animal (fémur, tibia y húmero), prestando atención a la preservación de la integridad ósea y evitando cortar la cabeza de los huesos durante la recolección24. En un plato de 60 mm recubierto de BSA, retire los músculos y el tejido graso. Cortar la cabeza de los huesos para acceder a la médula y, a continuación, enjuagar y homogeneizar la médula ósea con una jeringa (aguja de 27 G) llena de HBSS. Filtre la solución en un tubo recubierto de BSA de 15 ml con un colador de 40 μm y centrifugue a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Aspire el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 1 mL de ACK durante 30 s para lisar los glóbulos rojos y, a continuación, añada 9 mL de HBSS para detener la lisis. Centrifugar la solución a 400 x g durante 5 min en RT. Prepare un gradiente de pasos de densidad en un tubo recubierto de BSA de 15 mL colocando suavemente 4 mL de 1119 Histopaque en la parte inferior del tubo y, a continuación, colocando suavemente 4 mL de 1077 Histopaque en la parte superior. Tenga especial cuidado para evitar mezclar las dos capas. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 2 mL de HBSS. Coloque suavemente la solución en capas sobre el gradiente escalonado preparado anteriormente. Gire a 1.000 x g durante 30 minutos a RT con la velocidad de aceleración y desaceleración más baja posible (se prefiere “sin freno”). Desde la parte superior del tubo, aspire suavemente la mitad de la capa 1077 Histopaque. Recoja la mitad restante de la capa 1077 Histopaque y la mitad superior de la capa 1119 Histopaque en un tubo nuevo recubierto de BSA. La suspensión celular turbia entre las dos capas de densidad contiene predominantemente neutrófilos. Agregue HBSS para alcanzar un volumen final de 15 mL y mezcle suavemente invirtiendo el tubo. Girar a 400 x g durante 5 min a RT. Después de la centrifugación, vuelva a suspender y lavar el pellet de celda con 10 mL de HBSS y centrifugue a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Repita el procedimiento y, a continuación, vuelva a suspender el pellet en 15 ml de HBSS para determinar el número de células utilizando un contador de células. Por último, centrifugar y resuspender las células en 1 mL de HBSS y transferirlas a un tubo recubierto de BSA de 1,5 mL. Después de la purificación, mantenga la suspensión de neutrófilos en el tubo recubierto de BSA bajo agitación suave durante 30 minutos en un rotador de tubo en RT hasta el etiquetado y/o la inyección.NOTA: Una purificación exitosa produce 10-20 x 106 neutrófilos por ratón con una pureza del 95%. La pureza se evalúa mediante citometría de flujo, utilizando marcadores de neutrófilos previamente descritos (Ly6G+, Ly6C-, Gr1+ y CD11b+)25,26.NOTA: Los protocolos de purificación de neutrófilos a partir de sangre periférica humana y médula ósea de ratón están disponibles anteriormente24,27. 3. Marcaje de neutrófilos NOTA: Para visualizar los neutrófilos, se purificaron a partir de ratones LyzM-Cre mT/mG , en los que las células mieloides expresan un péptido dirigido a la membrana fusionado con el GFP. Además, los neutrófilos purificados de ratones de tipo salvaje (WT) se marcaron in vitro. Los siguientes pasos describen el procedimiento utilizado para marcar neutrófilos purificados con un colorante fluorescente verde comercial permeable a las células y se puede adaptar a cualquier otra sonda fluorescente compatible con MPM de elección. Agregue el tinte verde fluorescente (concentración recomendada por el fabricante; en este caso, 1 μM) a la suspensión de neutrófilos (purificada a partir de ratón WT) en un tubo de 1,5 mL recubierto de BSA. Incubar durante 30 min en RT bajo agitación suave en un rotador de tubos. Lavar tres veces con HBSS, centrifugar a 400 x g durante 5 min a RT y volver a suspender el pellet en 1 mL de HBSS. Mantenga la suspensión de neutrófilos en el tubo recubierto de BSA bajo agitación suave en un rotador de tubo en RT hasta el procedimiento de inyección.NOTA: Es muy preferible la inyección de neutrófilos marcados inmediatamente después del marcado. Sin embargo, si es necesario, los neutrófilos marcados pueden mantenerse en agitación durante 10-15 minutos adicionales después del marcaje sin comprometer la integridad de la respuesta de los neutrófilos in vivo. La agitación a largo plazo (más de 60 minutos después del etiquetado) provocará aglomeraciones, muerte de neutrófilos y observaciones engañosas in vivo. Justo antes de la inyección, vuelva a suspender el gránulo de células en solución salina para alcanzar una densidad de 2-5 x 106 células por 20 μL. 4. Inyección de neutrófilos NOTA: La anestesia debe realizarse siguiendo las pautas institucionales del Comité de Cuidado y Uso de Animales locales. Colocar al animal en una cámara cerrada y administrar isoflurano al 3%-5% (caudal de 2 L/min) utilizando un vaporizador calibrado conectado a un concentrador de oxígeno. Evalúe si el animal está inconsciente probando el reflejo de retirada de la pata al pellizcar la almohadilla de la pata trasera. Luego, transfiera al animal a una almohadilla térmica (37 ° C) para mantener su temperatura corporal. Continuar administrando el isoflurano (1%-2%; caudal de 0,5 L/min) a través de un cono nasal.NOTA DE SEGURIDAD: Para limitar la exposición del personal al isoflurano tóxico, se recomienda el uso de un sistema dispensador equipado con una unidad de filtrado para recuperar el isoflurano circulante. Para optimizar la calidad de la imagen, elimine los pelos de la oreja con una recortadora fina. Este procedimiento también se puede realizar uno o dos días antes del experimento.NOTA: Se desaconseja el uso de crema depilatoria, ya que se sabe que exacerba la respuesta inflamatoria en la piel del ratón e introduce artefactos de imagen. Coloca al animal de lado. Con cinta quirúrgica, sostenga el borde de la oreja y aplánelo a lo largo de la almohadilla térmica. Aplique suavemente la cinta para evitar cualquier daño en el oído. Llene una jeringa equipada con una aguja de 33 G con la suspensión de neutrófilos (2-5 x 106 células por 20 μL) y móntela en un micromanipulador.NOTA: El ángulo de inyección entre la aguja y la oreja en una almohadilla térmica debe estar entre 10° y 30° para minimizar el daño tisular y aumentar el éxito de la inyección celular. Mueva suavemente la aguja (con el bisel hacia arriba) hacia la oreja y perfore lentamente la piel. Una vez que la aguja esté dentro de la piel, empuje lentamente el pistón y administre 2-3 μL de suspensión celular.NOTA: Deben evitarse las áreas con vasos sanguíneos visibles, ya que dañar un vaso sanguíneo da como resultado una respuesta inmunitaria compleja y no deseada a la inyección y problemas con las imágenes. Repita la inyección en 2-3 áreas diferentes de la oreja, preferiblemente a 2-3 mm de distancia. No “llene en exceso” el oído con la suspensión celular.NOTA: La inyección debe realizarse en el centro de la oreja. La periferia de la oreja es delgada y debe manipularse con cuidado, ya que puede dañarse fácilmente, mientras que la parte central es más gruesa, contiene vasos sanguíneos más grandes y menos folículos pilosos, y puede soportar mayores volúmenes de inyección. Retire con cuidado la cinta quirúrgica y deje que el animal recupere la conciencia bajo supervisión. Deje que el animal descanse durante 1 hora antes de tomar imágenes para que el tejido y las células se recuperen del procedimiento de inyección. 5. Anestesia para la IVM NOTA: Una anestesia más profunda mejora significativamente la calidad de la imagen al disminuir los artefactos de movimiento debidos a los latidos del corazón y la respiración. Los ratones inyectados con neutrófilos se someten a anestesia química, que proporciona una sedación más profunda que la anestesia inducida por gases. La anestesia debe realizarse siguiendo las pautas del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucionales locales. Una hora después de la recuperación de la inyección de neutrófilos, anestesiar a los animales mediante una inyección subcutánea que contiene una mezcla de xilacina/ketamina/acepromazina (80 mg·kg-1, 2 mg·kg-1 y 4 mg·kg-1, respectivamente) en solución salina.NOTA: Para garantizar la reproducibilidad y fiabilidad de los resultados, los animales deben mantenerse calientes desde el momento de la anestesia hasta el final del experimento utilizando una almohadilla térmica o una almohadilla de circulación de agua conectada a una bomba de calentamiento. Para mantener la anestesia más allá de 1 h, inyecte una mezcla de Ketamina/Acepromazina (40 mg·kg-1 y 2 mg·kg-1 respectivamente) por vía subcutánea cada 40 min. Monitoree periódicamente a los ratones anestesiados para detectar signos de conciencia mediante la prueba del reflejo de retirada de las patas. Además, para los procedimientos de diagnóstico por imágenes que duran más de 1 hora, aplique un ungüento oftálmico estéril sin medicamentos en los ojos para evitar la sequedad de la córnea durante la anestesia y mantener la hidratación corporal mediante inyecciones subcutáneas de solución salina (200 μL cada hora).NOTA: Alternativamente, se puede utilizar un sistema basado en perfusión controlado digitalmente para garantizar una inyección periódica y suave de la solución de anestesia y/o proporcionar líquidos. Se puede configurar un controlador de jeringa automatizado para administrar el volumen deseado de anestésico y proporcionar hidratación durante períodos más largos. Para ello, se puede introducir una aguja de infusión alada por vía subcutánea en la piel dorsal del animal y asegurarla con cinta quirúrgica. 6. Imágenes NOTA: La configuración del animal y los parámetros de imagen descritos aquí están optimizados para un microscopio multifotónico invertido equipado con una sola línea láser para excitar y recoger simultáneamente las emisiones de los diferentes fluoróforos. Antes de colocar el animal anestesiado en la platina del microscopio, asegúrese de que el microscopio esté encendido y de que tanto la platina como las lentes estén precalentadas a 37 °C. Cubra el orificio en el escenario con un cubreobjetos de vidrio (grosor # 1 o 1.5) que esté alineado con la lente calentada. Mueve al animal al escenario con cuidado. Si se planea tomar imágenes de larga duración (>1 h), aplique ungüento oftálmico y asegure el sistema de perfusión basado en infusión alado como se describió anteriormente. Coloque una gota de solución salina en el centro del cubreobjetos y coloque la oreja inyectada con neutrófilos encima. Aplana suavemente la oreja con un bastoncillo de algodón estéril en el centro del cubreobjetos para eliminar las bolsas de aire.NOTA: La aplicación de solución salina (o PBS) entre el oído y el cubreobjetos reduce la refracción de la luz debido a las bolsas de aire, lo que garantiza un índice de refracción uniforme y una calidad de imagen superior. Asegure la oreja presionando suavemente un palo de madera (retirado del hisopo de algodón) en el lado de la oreja más cercano a la cabeza del animal y bloqueándolo con cinta adhesiva (Figura 1A).NOTA: Un palo de madera asegurado minimiza los artefactos de movimiento debidos a los latidos del corazón y la respiración y aumenta drásticamente la calidad de la imagen. Es importante destacar que el palo de madera debe sujetarse lo suficiente para estabilizar el oído sin perjudicar el flujo sanguíneo. Con el ocular del microscopio, encuentre un área de interés y, a continuación, cambie al modo de adquisición multifotónica. Ajuste la longitud de onda de excitación del láser a 900-930 nm para permitir la adquisición simultánea de GFP / colorante fluorescente verde, mTomato y colágeno-I (a través de SHG). Establezca un conjunto adecuado de espejos y una combinación de filtros en los detectores para recoger la luz emitida (filtros de paso de banda: Azul = 410-460 nm, Verde = 495-540 nm, Rojo = 580-640 nm).NOTA: Los neutrófilos inyectados, cuando están marcados con un tinte fluorescente verde, exhiben una fuerte fluorescencia verde que los hace visibles bajo el ocular del microscopio, incluso si se inyectan en partes más profundas del oído. Determine la configuración más adecuada para la configuración de hardware. Incluso si las células migratorias se pueden rastrear con un intervalo de 30 s a 1 min, las imágenes de los eventos subcelulares se obtienen imágenes con una velocidad más alta (al menos <10 s de intervalo). En el siguiente ejemplo, se presentan dos configuraciones de imágenes diferentes para mostrar la diferencia entre IVM clásica e ISMic.En el enfoque clásico de IVM para rastrear la migración celular e investigar el tejido del ratón huésped (Figura 1), se utiliza una lente de 30x y un escáner galvo con un tamaño de imagen de 512 x 512 píxeles (tamaño de píxel de 0,83 μm), y se establece el desplazamiento del eje z utilizando la platina motorizada con un tamaño de paso de 2 μm, lo que permite obtener imágenes de un volumen de profundidad de 30 μm cada 30 s. En el enfoque ISMic para la remodelación de membranas altamente dinámicas de imágenes con un aumento y una resolución más altos (Figura 2), use una lente de 40x y un escáner resonante con un promedio de 3x y un tamaño de imagen de 512 x 512 píxeles (tamaño de píxel de 0.25 μm), y establezca el desplazamiento del eje z usando un piezoeléctrico con un tamaño de paso de 1 μm, Permite obtener imágenes de 20 μm de volumen de profundidad cada 4-5 s. Desencadena la migración de neutrófilos al inducir una lesión estéril por láser. Enfoque el láser de excitación a una potencia alta suficiente para alcanzar al menos 80 mW22, en un área estrecha del tejido (20 μm x 20 μm) durante 10 s. Identificar la lesión inducida por láser por sus fuertes señales autofluorescentes que aparecen en todos los canales y por la alteración resultante de la disposición del colágeno (Figura 1D).NOTA: Para obtener resultados fiables, la lesión debe inducirse siempre lo más lejos posible de los vasos sanguíneos; Si se rompen, las células sanguíneas liberadas en el tejido afectarán la calidad de las imágenes y darán lugar a una fuerte reacción inmunitaria general. Guarde los datos al final de la experimentación para análisis posteriores. Sacrificar al animal de acuerdo con las directrices institucionales locales. Si es necesario, se puede recolectar tejido para su fijación y posterior procesamiento. 7. Análisis de datos representativos NOTA: Los datos se pueden visualizar y analizar con el software del microscopio, software de terceros o programas personalizados. El procedimiento y las herramientas utilizadas dependen de las necesidades específicas de los investigadores. Aquí se muestra un ejemplo de un flujo de trabajo para cuantificar la curvatura de la membrana y los cambios en el área local en el borde delantero y la parte trasera de los neutrófilos migratorios. Abra los archivos de imagen con Imaris o Fiji para visualizar la migración de los neutrófilos en 4D y determinar la calidad del experimento.NOTA: Imaris y Fiji pueden leer el formato de imagen de varias marcas de microscopios. Procese los datos con los siguientes pasos mediante la ejecución de scripts de código de MATLAB personalizados. Lea los archivos de imagen seleccionados con el paquete Bio-Formats28 para MATLAB. Segmente cada fotograma del volumen 3D con el algoritmo Otsu29 para identificar las celdas individuales. Realice un seguimiento de los objetos identificados en función del criterio de desplazamiento mínimo30. Determine los contornos y límites activos del objeto.Genere una proyección máxima para cada objeto identificado en un período de tiempo. Aplique la función bwboundaries en MATLAB a la proyección máxima de cada objeto identificado del paso 7.2 para generar 100 puntos de límite. Optimice los puntos de contorno identificados con el algoritmo de contorno dinámico para lograr una precisión de subpíxel31 (Figura 3A) utilizando las funciones del paquete de MATLAB descargado a través de http://www.iacl.ece.jhu.edu/static/gvf/. Superponga los límites del objeto y el índice de trayectoria del objeto determinado por el seguimiento en el paso 7.3 con la proyección máxima de la imagen original para generar una salida de una película superpuesta en 2D para la visualización y la comprobación manual. En la película superpuesta, seleccione manualmente todos los objetos identificados como celdas en migración excluyendo los objetos que no son celdas, los objetos que tocan y los objetos con límites incompletos. Registre los índices de seguimiento, los fotogramas de inicio y fin de cada celda en una hoja de cálculo que se utilizará como entrada para los siguientes pasos implementados por los scripts de código de MATLAB. Realice un seguimiento de los puntos de límite de la celda de cada fotograma al siguiente de acuerdo con el criterio de desplazamiento mínimo. Utilice la función Polyarea de MATLAB para calcular el área subrayada por puntos de contorno adyacentes en dos períodos de tiempo consecutivos (Figura 3C). Si el límite de la celda local se mueve hacia afuera de la celda, asigne un signo positivo al cambio de área. Si el límite de la celda local se mueve hacia adentro de la celda, asigne un signo negativo al cambio de área. Mida la curvatura local de la membrana en cada punto límite para cada marco ajustando sus puntos límite vecinos a un círculo (5 por lado; total 11)32 (Figura 3B). Genere kymographs utilizando la función imagesc en MATLAB (Figuras 3D,E) para mostrar los cambios de las características subcelulares a lo largo del tiempo y relacionarlas con la posición de la celda.