生理条件下での細胞内膜リモデリングを調査するためのマウス皮膚における好中球移動のイメージング

すべての動物実験および手順は、米国国立がん研究所(米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ)の動物管理および使用委員会(プロトコルLCMB-031およびLCMB-035)によって承認され、関連するすべての倫理規制に準拠していました。実験には、生後2か月から6か月の雄マウスと雌マウスの両方を使用しました。 mT/mG および野生型(WT)宿主マウスはFVB/NJバックグラウンドにあり、 LyzM-Cre x mTmG マウスはC57BL/6バックグラウンドにあります。 1. 試薬・ツールの材料・調製 チューブ、ディッシュ、針/シリンジにPBS + 1%BSA(カルシウムとマグネシウムなし)を攪拌しながら一晩コーティングします。 動物の作業に使用する表面や道具/器具は、70%エタノールを使用するか、オートクレーブで慎重に清掃してください。好中球の精製には、以下を準備します:3 x 15 mLチューブ、1 x 60 mmディッシュ、1 x 1.5 mLチューブ。10 mM HEPES(pH 7.3)を含むHBSS;赤血球溶解液(ACK);ヒストパケ1077;とHistopaque 1119。 好中球注射の場合は、低容量シリンジ 1 個 (10 μL)、33 G 斜め針 1 個、イソフルラン、麻酔液 (ケタミン、キシラジン、アセプロマジンをそれぞれ 80 mg・kg-1、2 mg・kg-1 、4 mg・kg-1 の生理食塩水に溶かします) を準備します。 2. ドナーマウスからの好中球の精製 ドナーマウスを地域の機関規制に従って安楽死させます。 動物から長骨(大腿骨、脛骨、上腕骨)を収集し、骨の完全性を維持し、収集中に骨の頭を切らないように注意を払います24。 BSAコーティングされた60mmの皿で、筋肉と脂肪組織を取り除きます。骨の頭を切開して骨髄にアクセスし、HBSSを充填したシリンジ(27G針)を使用して骨髄を洗い流し、均質化します。 40 μmストレーナーを使用して溶液を15 mL BSAコーティングチューブにろ過し、室温(RT)で400 x g で5分間遠心分離します。 上清を吸引し、ペレットを1 mLのACKに再懸濁して30秒間赤血球を溶解し、次に9 mLのHBSSを加えて溶解を停止します。溶液を400 x g でRTで5分間遠心分離します。 15 mL BSAコーティングチューブの底部に4 mLの1119 Histopaqueを静かに置き、さらに4 mLの1077 Histopaqueを上部に穏やかに重ねることで、密度ステップグラジエントを調製します。2つのレイヤーが混ざらないように特に注意してください。 上清を吸引し、細胞ペレットを2mLのHBSSに再懸濁します。上記で準備したステップグラジエントの上に溶液を穏やかに重ねます。1,000 x g で30分間、加速速度と減速速度をできるだけ低くしてRTで回転します(「ブレーキなし」が望ましい)。 チューブの上部から、1077 Histopaque 層の半分を静かに吸引します。1077 Histopaque 層の残りの半分と 1119 Histopaque 層の上半分を新しい BSA コーティング チューブに集めます。2つの密度層の間の曇った細胞懸濁液には、主に好中球が含まれています。 HBSSを加えて最終容量15 mLにし、チューブを反転させて穏やかに混合します。400 x g で5分間室温で遠心します。 遠心分離後、細胞ペレットを再懸濁して10 mLのHBSSで洗浄し、室温で400 x g で5分間遠心します。この手順を繰り返してから、ペレットを15 mLのHBSSに再懸濁し、セルカウンターを使用して細胞数を決定します。最後に、細胞を1 mLのHBSSでスピンして再懸濁し、1.5 mLのBSAコーティングチューブに移します。 精製後、好中球懸濁液をBSAコーティングチューブ内に保持し、室温のチューブ回転子で30分間穏やかに攪拌し、標識および/または注入を行います。注:精製が成功すると、マウスあたり10-20 x 106の好中球が95%の純度で得られます。純度は、以前に報告された好中球マーカー(Ly6G+、Ly6C-、Gr1+、およびCD11b+)25,26を用いて、フローサイトメトリーによって評価される。注:ヒト末梢血およびマウス骨髄からの好中球精製に関するプロトコルは、以前に利用可能でした24,27。 3. 好中球の標識 注:好中球を視覚化するために、骨髄細胞がGFPと融合した膜標的ペプチドを発現する LyzM-Cre mT/mG マウスから好中球を精製しました。さらに、野生型(WT)マウスの精製好中球を in vitroで標識しました。次の手順では、精製した好中球を市販の細胞透過性緑色蛍光色素で標識するために使用される手順を説明しており、他の任意のMPM適合蛍光プローブにも適合させることができます。 1.5 mL BSAコーティングチューブ内の好中球懸濁液(WTマウスから精製)に緑色蛍光色素(メーカー推奨濃度、ここでは1 μM)を加えます。チューブローテーター内で穏やかに攪拌しながら、室温で30分間インキュベートします。 HBSSを用いて3回洗浄し、室温で400 x g で5分間遠心し、ペレットを1 mLのHBSSに再懸濁します。 BSAコーティングされたチューブ内の好中球懸 ?? 液を、注入手順までRTのチューブ回転子で穏やかに攪拌します。.注:標識直後に行われる標識好中球の注入が非常に好ましい。ただし、必要に応じて、標識された好中球を標識後さらに10〜15分間攪拌下に置いておくことができますが、 in vivoでの好中球応答の完全性を損なうことはありません。長期間の攪拌(標識後60分以上)は、凝集、好中球死、 およびin vivoでの誤解を招く観察につながります。 注入の直前に、細胞ペレットを生理食塩水に再懸濁して、20μLあたり2〜5×106 細胞の密度になるようにします。 4. 好中球注射 注:麻酔は、地元の施設の動物管理および使用委員会のガイドラインに従って実施する必要があります。 動物を密閉チャンバーに入れ、酸素濃縮器に接続された校正済みの気化器を使用して3%〜5%イソフルラン(流量2 L /分)を投与します。 後足をつまんだときの足の離脱反射をテストすることにより、動物が意識を失っているかどうかを評価します。次に、動物を体温を維持するために保温パッド(37°C)に移します。イソフルラン(1%-2%;流量0.5 L / min)をノーズコーンを通して投与し続けます。.安全上の注意:有毒なイソフルランへの人員の曝露を制限するために、循環イソフルランを再捕捉するためのフィルタリングユニットを備えたディスペンサーシステムの使用をお勧めします。 画像品質を最適化するには、細かいトリマーを使用して耳から毛を取り除きます。この手順は、実験の1日か2日前に行うこともできます。注:脱毛クリームの使用は、マウスの皮膚の炎症反応を悪化させ、イメージングアーチファクトを導入することが知られているため、お勧めしません。 動物を横に置きます。サージカルテープを使用して、耳の端を保持し、ウォーミングパッドに沿って平らにします。耳への損傷を防ぐために、テープをそっと貼り付けます。 33G針を装備したシリンジに好中球懸濁液(20μLあたり2-5×106 細胞)を充填し、マイクロマニピュレーターに装着します。注:加温パッド上の針と耳の間の注入角度は、組織の損傷を最小限に抑え、細胞注入の成功率を高めるために、10°から30°の間でなければなりません。 針を(面角を上にして)耳に向かってゆっくりと動かし、ゆっくりと皮膚に穴を開けます。針が皮膚の内側に入ったら、ピストンをゆっくりと押して、2〜3μLの細胞懸濁液を送液します。注:血管が見える領域は、血管を損傷すると、注射に対する望ましくない複雑な免疫反応やイメージングの問題を引き起こすため、避ける必要があります。 耳の2〜3の異なる領域、できれば2〜3mm間隔で注入を繰り返します。細胞懸濁液で耳を「いっぱい」にしないでください。注:注射は耳の中央で行う必要があります。耳の周辺部は細く、傷みやすいため取り扱いに注意が必要ですが、中央部は太く、血管が大きく、毛包が少なく、より多くの注入量に耐えることができます。 サージカルテープを慎重にはがし、監督下で動物が意識を取り戻すのを待ちます。イメージングの前に動物を1時間休ませて、組織と細胞を注射手順から回復させます。 5. IVMのための麻酔 注:より深い麻酔は、心拍と呼吸による運動アーチファクトを減らすことにより、画像品質を大幅に向上させます。好中球を注入したマウスには化学麻酔がかけられ、ガスによる麻酔よりも深い鎮静作用が得られます。麻酔は、地元の施設の動物管理および使用委員会のガイドラインに従って実施する必要があります。 好中球注射からの回復から1時間後、生理食塩水にキシラジン/ケタミン/アセプロマジンの混合物(それぞれ80 mg・kg-1、2 mg・kg-1、 4 mg・kg-1)を含む皮下注射により動物に麻酔をかけます。.注:結果の再現性と信頼性を確保するために、麻酔時から実験終了まで、加温ポンプに接続された加熱パッドまたは水循環パッドを使用して動物を温めておく必要があります。 1時間を超えて麻酔を維持するには、ケタミン/アセプロマジンの混合物(それぞれ40 mg・kg-1および2 mg・kg-1 )を40分ごとに皮下に注入します。.麻酔をかけたマウスを定期的に監視し、足の離脱反射をテストして意識の兆候がないか確認します。 また、1時間以上経過する画像検査では、麻酔時の角膜乾燥を防ぐとともに、生理食塩水(1時間あたり200μL)の皮下注射により体の水分補給を維持するために、無菌の非薬物用眼科用軟膏を眼に塗布します。注:あるいは、デジタル制御の灌流ベースのシステムを使用して、麻酔液の定期的かつスムーズな注入を確保し、および/または液体を供給することもできます。自動シリンジドライバーは、必要な量の麻酔薬を供給するように設定でき、長時間の水分補給を提供します。この目的のために、翼のある注入針を動物の背側皮膚に皮下に挿入し、外科用テープで固定することができる。 6. イメージング 注:ここで説明する動物のセットアップとイメージングパラメータは、異なる蛍光色素からの放出を励起し、同時に収集するための単一のレーザーラインを備えた倒立多光子顕微鏡用に最適化されています。 麻酔をかけた動物を顕微鏡ステージに置く前に、顕微鏡の電源がオンになっていて、ステージとレンズの両方が37°Cに予熱されていることを確認してください。 ステージの穴を、加熱されたレンズと位置合わせされたガラスカバースリップ(厚さ#1または1.5)で覆います。 動物を慎重にステージに移動します。イメージングが長期間(>1時間)計画されている場合は、眼科用軟膏を塗布し、上記のように翼型注入ベースの ?? 流システムを固定します。. カバーガラスの中央に生理食塩水を一滴垂らし、その上に好中球を注入した耳を置きます。カバースリップの中央を横切る滅菌綿棒を使用して耳をそっと平らにし、エアポケットを取り外します。注:耳とカバースリップの間に生理食塩水(またはPBS)を塗布すると、エアポケットによる光の屈折が減少するため、均一な屈折率と優れた画像品質が保証されます。 木の棒(綿棒から取り外したもの)を動物の頭に近い耳の側面にそっと押し付け、テープでロックして耳を固定します(図1A)。注:固定された木製の棒は、心拍や呼吸による運動アーチファクトを最小限に抑え、画像品質を劇的に向上させます。重要なのは、木の棒は、血流を損なうことなく耳を安定させるのに十分なだけ固定する必要があるということです。 顕微鏡の接眼レンズを使用して、関心のある領域を見つけ、多光子取得モードに切り替えます。 レーザー励起波長を900-930 nmに設定すると、GFP/緑色蛍光色素、mTomato、およびコラーゲン-I(SHG経由 )を同時に取得できます。 放出された光を収集するために、検出器に適切なミラーとフィルターの組み合わせを設定します(バンドパスフィルター:青= 410-460 nm、緑= 495-540 nm、赤= 580-640 nm)。注:注入された好中球は、緑色蛍光色素で標識すると、強い緑色蛍光を示し、耳のより深い部分に注入しても顕微鏡の接眼レンズの下で見ることができます。 ハードウェア構成に最も適した設定を決定します。遊走細胞を30秒から1分間隔で追跡できる場合でも、細胞内イベントをより速い速度(少なくとも<10秒間隔)で画像化します。以下の例では、従来のIVMとISMicの違いを示すために、2つの異なるイメージングセットアップが示されています。従来のIVMアプローチでは、細胞遊走を追跡し、宿主マウス組織を調査する(図1)場合、30倍レンズと画像サイズ512×512ピクセル(ピクセルサイズ0.83μm)のガルボスキャナーを使用し、ステップサイズ2μmの電動ステージを使用してz軸変位を設定し、30秒ごとに30μmの深さのボリュームをイメージングすることができます。 ISMicのアプローチでは、高倍率・高分解能で高ダイナミックな膜リモデリングを行う(図2)では、40倍レンズと3倍平均で画像サイズ512×512ピクセル(画素サイズ0.25μm)のレゾナントスキャナーを使用し、ステップサイズ1μmのピエゾでz軸変位を設定します。 4〜5秒ごとに20μmの深さのボリュームのイメージングが可能です。 滅菌レーザー損傷を誘発することにより、好中球の移動を引き起こします。励起レーザーを、組織の狭い領域(20μm×20μm)に少なくとも80mW22に達するのに十分な高出力で10秒間集束します。 レーザー誘発性損傷は、すべてのチャネルに現れる強力な自己蛍光シグナルと、その結果として生じるコラーゲン配列の変化によって特定されます(図1D)。注:信頼性の高い結果を得るためには、常に血管からできるだけ離れた場所に損傷を誘発する必要があります。破裂すると、組織に放出された血液細胞がイメージング品質に影響を与えるだけでなく、全体的に強力な免疫反応を引き起こします。 実験の最後にデータを保存して、さらに分析できるようにします。 地元の機関のガイドラインに従って動物を安楽死させます。必要に応じて、組織を採取して固定し、さらに処理することができます。 7. 代表的なデータ分析 注:データは、顕微鏡ソフトウェア、サードパーティソフトウェア、またはカスタマイズされたプログラムのいずれかで視覚化および分析できます。使用される手順とツールは、研究者の特定のニーズによって異なります。ここに示されているのは、移動する好中球の前縁と後部の膜の曲率と局所領域の変化を定量化するワークフローの一例です。 ImarisまたはFijiでイメージングファイルを開き、好中球の移動を4Dで視覚化し、実験の品質を判断します。注:ImarisとFijiは、いくつかの顕微鏡ブランドのイメージング形式を読み取ることができます。 次の手順で、カスタマイズされた MATLAB コード スクリプトを実行してデータを処理します。選択したイメージングファイルを MATLAB 用の Bio-Formats28 パッケージで読み取ります。3Dボリュームの各フレームをOtsuアルゴリズム29 でセグメント化して、個々のセルを識別する。 最小変位基準30に基づいて識別されたオブジェクトを追跡する。 オブジェクトのアクティブな輪郭と境界を決定します。時間枠内で識別された各オブジェクトの最大投影を生成します。 MATLAB の関数 bwboundaries をステップ 7.2 で識別された各オブジェクトの最大射影に適用して、100 個の境界点を生成します。 動的等高線アルゴリズムで特定された境界点を最適化し、http://www.iacl.ece.jhu.edu/static/gvf/ 経由でダウンロードしたMATLABパッケージの関数を使用して、サブピクセル精度31(図3A)を達成します。 オブジェクトの境界と、ステップ 7.3 のトラッキングによって決定されたオブジェクトの軌道インデックスを元の画像の最大投影と重ね合わせて、視覚化と手動チェック用の 2D オーバーレイ ムービーの出力を生成します。 オーバーレイされたムービーで、非セルオブジェクト、接触しているオブジェクト、および境界が不完全なオブジェクトを除外して、移動セルとして識別されたすべてのオブジェクトを手動で選択します。各セルの軌跡のトラッキング インデックス、開始フレーム、終了フレームをスプレッドシートに記録し、MATLAB コード スクリプトによって実装される次の手順の入力として使用します。 各フレームから次のフレームまでのセル境界点を、最小変位基準に従って追跡します。MATLAB の 関数 Polyarea を使用して、2 つの連続する時間枠で隣接する境界点によって下線が引かれた面積を計算します (図 3C)。ローカル セル境界がセルから外側に移動する場合は、領域の変更に正の符号を割り当てます。ローカル セルの境界がセルの内側に移動する場合は、領域の変更に負の符号を割り当てます。 各フレームの各境界点における局所的な膜の曲率を測定するには、隣接する境界点を円(片側5個、合計11個)32 に適合させる(図3B)。 MATLAB の imagesc 関数 (図 3D、E) を使用してキモグラフを生成し、細胞内の特徴の経時的な変化を示し、細胞の位置に関連付けます。