对小鼠皮肤中的中性粒细胞迁移进行成像，以研究生理条件下的亚细胞膜重塑

所有动物实验和程序均获得美国国家癌症研究所（美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）动物护理和使用委员会（协议 LCMB-031 和 LCMB-035）的批准，并符合所有相关的道德法规。实验使用2至6个月大的雄性和雌性小鼠。 mT/mG 和野生型 （WT） 宿主小鼠处于 FVB/NJ 背景中，而 LyzM-Cre x mTmG 小鼠处于 C57BL/6 背景中。 1.试剂和工具的原料和准备 在搅拌下用 PBS + 1% BSA（不含钙和镁）涂覆试管、培养皿和针头/注射器过夜。 使用 70% 乙醇或高压灭菌仔细清洁用于动物工作的表面和工具/器械。对于中性粒细胞纯化，准备以下内容：3 x 15 mL 试管、1 x 60 mm 培养皿、1 x 1.5 mL 试管;含有 10 mM HEPES 的 HBSS （pH 7.3）;红细胞裂解液（ACK）;Histopaque 1077;和 Histopaque 1119。 对于中性粒细胞注射，准备以下内容：1 x 低容量注射器 （10 μL）、1 x 33 G 斜面针、异氟烷和麻醉溶液（氯胺酮、甲苯噻嗪和醋丙嗪在盐水溶液中分别为 80 mg·kg-1、2 mg·kg-1 和 4 mg·kg-1）。 2. 从供体小鼠中纯化中性粒细胞 根据当地机构规定对供体小鼠实施安乐死。 从动物身上采集长骨（股骨、胫骨和肱骨），注意保持骨骼完整性，避免在采集过程中割伤骨头24. 在 BSA 涂层的 60 毫米培养皿中，去除肌肉和脂肪组织。切开骨头以进入骨髓，然后使用装满 HBSS 的注射器（27 G 针头）冲洗和均质化骨髓。 使用 40 μm 过滤器将溶液过滤到 15 mL BSA 包被的管中，并在室温 （RT） 下以 400 x g 离心 5 分钟。 吸出上清液，将沉淀重悬于 1 mL ACK 中 30 秒以裂解红细胞，然后加入 9 mL HBSS 以停止裂解。在室温下以400× g 离心溶液5分钟。 在 15 mL BSA 包被的试管中制备密度梯度，方法是轻轻地将 4 mL 的 1119 Histopaque 放在试管底部，然后在顶部轻轻分层 4 mL 的 1077 Histopaque。要格外小心，避免混淆两层。 吸出上清液并将细胞沉淀重悬于 2 mL HBSS 中。轻轻地将溶液分层在上面准备好的步骤梯度上。在室温下以 1,000 x g 旋转 30 分钟，尽可能低的加速和减速速度（“无制动”是首选）。 从管子的顶部，轻轻吸出 1077 Histopaque 层的一半。将 1077 Histopaque 层的剩余一半和 1119 Histopaque 层的上半部分收集到新鲜的 BSA 涂层管中。两个密度层之间的混浊细胞悬浮液主要含有中性粒细胞。 加入 HBSS 以达到 15 mL 的最终体积，并通过倒置试管轻轻混合。在室温下以400× g 旋转5分钟。 离心后，重悬并用 10 mL HBSS 洗涤细胞沉淀，并在室温下以 400 x g 旋转 5 分钟。重复该过程，然后将沉淀重悬于 15 mL HBSS 中，以使用细胞计数仪确定细胞数。最后，将细胞旋转并重悬于 1 mL HBSS 中，然后转移到 1.5 mL BSA 包被的管中。 纯化后，将中性粒细胞悬浮液保持在 BSA 包被的管中，在室温下在管旋转器上轻轻搅拌 30 分钟，直到标记和/或注射。注：成功纯化可产生每只小鼠 10-20 x 106 个中性粒细胞，纯度为 95%。通过流式细胞术评估纯度，使用先前描述的中性粒细胞标志物（Ly6G+、Ly6C-、Gr1+ 和 CD11b+）25,26。注：从人外周血和小鼠骨髓中纯化中性粒细胞的方案以前可用24,27。 3. 中性粒细胞标记 注：为了可视化中性粒细胞，它们是从 LyzM-Cre mT/mG 小鼠中纯化的，其中髓样细胞表达与 GFP 融合的膜靶向肽。此外，来自野生型（WT）小鼠的纯化中性粒细胞在 体外被标记。以下步骤描述了用于用商业细胞渗透性绿色荧光染料标记纯化的中性粒细胞的程序，并可适用于任何其他选择的MPM兼容荧光探针。 在1.5mL BSA包被的试管中，将绿色荧光染料（制造商推荐浓度;此处为1μM）添加到中性粒细胞悬浮液（从WT小鼠纯化）中。在室温下在管旋转器中轻轻搅拌孵育 30 分钟。 使用HBSS洗涤3次，在室温下以400× g 旋转5分钟，并将沉淀重悬于1mL HBSS中。 在室温下，在管旋转器中轻轻搅拌将BSA涂层管中的中性粒细胞悬浮液保持到注射程序。注：标记后立即注射标记的中性粒细胞是非常优选的。然而，如有必要，标记的中性粒细胞可以在标记后再搅拌10-15分钟，而不会影响 体内中性粒细胞反应的完整性。长期搅动（标记后超过 60 分钟）将导致结块、中性粒细胞死亡和 体内误导性观察。 在注射前，将细胞沉淀重悬于盐水溶液中，以达到每 20 μL 2-5 x 106 个细胞的密度。 4.中性粒细胞注射液 注意：麻醉必须按照当地机构动物护理和使用委员会的指南进行。 将动物置于密闭腔室中，并使用连接到氧气浓缩器的校准蒸发器施用3%-5%异氟醚（流速为2L / min）。 通过在捏住后脚垫时测试爪子退出反射来评估动物是否失去知觉。然后，将动物转移到温暖垫（37°C）以保持其体温。继续通过鼻锥给予异氟醚（1%-2%;流速为0.5L / min）。安全说明：为限制人员接触有毒的异氟烷，建议使用配备过滤装置的分配器系统来重新捕获循环的异氟烷。 为优化成像质量，请使用精细修剪器去除耳朵上的毛发。此过程也可以在实验前一两天进行。注意：不鼓励使用脱毛膏，因为已知它会加剧小鼠皮肤中的炎症反应并引入成像伪影。 将动物侧放。使用手术胶带，握住耳朵的边缘，然后沿着保暖垫将其压平。轻轻贴上胶带，以防止对耳朵造成任何伤害。 用中性粒细胞悬浮液（每 20 μL 2-5 x 106 个细胞）填充装有 33 G 针头的注射器，并将其安装在显微操纵器上。注意： 针头和耳朵在加热垫上的注射角度必须在 10° 到 30° 之间，以最大限度地减少组织损伤并提高细胞注射的成功率。 轻轻地将针头（斜面朝上）移向耳朵，然后慢慢刺穿皮肤。一旦针头进入皮肤内，慢慢推动活塞并输送 2-3 μL 细胞悬液。注意：应避免使用有可见血管的区域，因为损坏血管会导致对注射产生不良和复杂的免疫反应以及成像问题。 在耳朵的 2-3 个不同区域重复注射，最好相距 2-3 毫米。不要用细胞悬浮液“过度填充”耳朵。注意：注射必须在耳朵中央进行。耳朵的外围很薄，必须小心处理，因为它很容易损坏，而中心部分较厚，包含较大的血管和较少的毛囊，并且可以承受更大的注射量。 小心地取下手术胶带，让动物在监督下恢复意识。在成像之前，让动物休息1小时，让组织和细胞从注射程序中恢复。 5. IVM 麻醉 注意： 深度麻醉通过减少由于心跳和呼吸引起的运动伪影来显着提高成像质量。注射中性粒细胞的小鼠接受化学麻醉，与气体诱导的麻醉相比，化学麻醉提供更深的镇静作用。麻醉必须按照当地机构动物护理和使用委员会的指南进行。 从中性粒细胞注射恢复后一小时，通过含有甲苯噻嗪/氯胺酮/乙酰丙嗪混合物（分别为80 mg·kg-1,2 mg·kg-1和 4 mg·kg-1）在盐水溶液中的皮下注射麻醉动物。注意：为确保结果的可重复性和可靠性，必须使用连接到加热泵的加热垫或水循环垫从麻醉到实验结束保持动物温暖。 为了维持麻醉超过 1 小时，每 40 分钟皮下注射氯胺酮/醋丙嗪（分别为 40 mg·kg-1 和 2 mg·kg-1 ）的混合物。通过测试爪子退出反射，定期监测麻醉小鼠的意识迹象。 此外，对于持续时间超过 1 小时的成像程序，将无菌非药物眼膏涂抹在眼睛上，以防止麻醉期间角膜干燥，并通过皮下注射生理盐水溶液（每小时 200 μL）保持身体水合作用。注意：或者，可以使用基于数字控制的灌注系统来确保定期和顺利地注射麻醉溶液和/或提供液体。可以设置自动注射器驱动器，以提供所需体积的麻醉剂并提供更长时间的补水。为此，可以将带翼的输液针皮下插入动物的背部皮肤中，并用手术胶带固定。 6. 影像学检查 注意：此处描述的动物设置和成像参数针对配备单条激光线的倒置多光子显微镜进行了优化，以激发并同时收集来自不同荧光团的发射。 在将麻醉动物放在显微镜载物台上之前，请确保显微镜已打开，并且载物台和镜头都预热至37°C。 用与加热镜片对齐的玻璃盖玻片（厚度 #1 或 1.5）盖住载物台上的孔。 小心地将动物移到舞台上。如果计划长时间（>1 小时）进行成像，则使用眼药膏并如上所述固定基于翼状输注的灌注系统。 在盖玻片的中心滴一滴生理盐水，然后将注射中性粒细胞的耳朵放在其顶部。用无菌棉签轻轻将耳朵压平，划过盖玻片的中心，以去除气穴。注意：在耳朵和盖玻片之间应用生理盐水（或 PBS）可减少由于气穴引起的光折射，从而确保均匀的折射率和卓越的成像质量。 将一根木棍（从棉签上取下）轻轻按压到耳朵靠近动物头部的一侧，并用胶带将其锁定，从而固定耳朵（图1A）。注意： 固定的木棒可最大限度地减少由于心跳和呼吸引起的运动伪影，并显着提高成像质量。重要的是，木棍必须固定得足够好，以稳定耳朵而不影响血液流动。 使用显微镜目镜，找到一个感兴趣的区域，然后切换到多光子采集模式。 将激光激发波长设置为 900-930 nm，以允许同时采集 GFP/绿色荧光染料、mTomato 以及 Colagen-I（通过 SHG）。 在探测器上设置适当的反射镜和滤光片组合以收集发射光（带通滤光片：蓝色 = 410-460 nm，绿色 = 495-540 nm，红色 = 580-640 nm）。注意：注射的中性粒细胞，当用绿色荧光染料标记时，会表现出强烈的绿色荧光，使它们在显微镜目镜下可见，即使注射到耳朵的较深部分也是如此。 确定最适合硬件配置的设置。即使可以以 30 秒到 1 分钟的间隔跟踪迁移细胞，也要以更高的速度（至少 <10 秒的间隔）对亚细胞事件进行成像。在下面的示例中，介绍了两种不同的成像设置，以显示经典 IVM 和 ISMic 之间的区别。在追踪细胞迁移和研究宿主小鼠组织（图1）的经典IVM方法中，使用30x镜头和图像尺寸为512 x 512像素（像素大小为0.83μm）的振镜扫描仪，并使用步长为2μm的电动平台设置z轴位移，允许每30秒成像30μm深的体积。 在以更高的放大倍率和分辨率对高动态膜重塑进行成像的 ISMic 方法中（图 2），使用 40 倍镜头和共振扫描仪，平均为 3 倍，图像尺寸为 512 x 512 像素（像素尺寸为 0.25 μm），并使用步长为 1 μm 的压电陶瓷设置 z 轴位移， 允许每 4-5 秒对 20 μm 深体积进行成像。 通过诱导无菌激光损伤来触发中性粒细胞迁移。将激发激光以足以达到至少 80 mW22 的高功率聚焦在组织的狭窄区域 （20 μm x 20 μm） 上 10 秒。 通过在所有通道中出现的强自发荧光信号以及由此产生的胶原排列改变来识别激光诱导的损伤（图1D）。注意：为了获得可靠的结果，必须始终尽可能远离血管诱发损伤;如果破裂，释放到组织中的血细胞将影响成像质量，并导致强烈的整体免疫反应。 在实验结束时保存数据以供进一步分析。 根据当地机构指南对动物实施安乐死。如果需要，可以收集组织进行固定和进一步处理。 7. 代表性数据分析 注意：可以使用显微镜软件、第三方软件或定制程序对数据进行可视化和分析。所使用的程序和工具取决于调查人员的具体需要。这里显示的是量化膜曲率和迁移中性粒细胞前缘和后部局部区域变化的工作流程示例。 打开带有 Imaris 或 Fiji 的成像文件，以 4D 形式可视化中性粒细胞的迁移并确定实验的质量。注意：Imaris 和 Fiji 可以读取多个显微镜品牌的成像格式。 通过运行自定义的 MATLAB 代码脚本，按照以下步骤处理数据。使用 MATLAB 的 Bio-Formats28 软件包读取选定的成像文件。使用 Otsu 算法29 分割 3D 体积的每一帧以识别单个单元格。 根据最小位移准则30 跟踪已识别的物体。 确定对象的活动轮廓和边界。为在时间范围内识别的每个对象生成最大投影。 将 MATLAB 中的 bwboundaries 函数应用于步骤 7.2 中每个已识别对象的最大投影，以生成 100 个边界点。 使用通过 http://www.iacl.ece.jhu.edu/static/gvf/ 下载的 MATLAB 包中的函数，优化使用动态轮廓算法识别的边界点，以实现亚像素精度31（图 3A）。 将步骤 7.3 中跟踪确定的物体边界和物体轨迹指数与原始图像的最大投影叠加，以生成 2D 叠加电影的输出，用于可视化和手动检查。 在叠加的影片中，通过排除非像元对象、触摸对象和边界不完整的对象，手动选择所有标识为迁移像元的对象。在电子表格中记录每个单元格轨迹的跟踪索引、开始帧和结束帧，以用作由 MATLAB 代码脚本实现的后续步骤的输入。 根据最小位移准则跟踪从每一帧到下一帧的像元边界点。使用MATLAB中的 Polyarea 函数计算两个连续时间范围内由相邻边界点下划线的区域（图3C）。如果局部像元边界从像元向外移动，则为面积变化分配一个正号。如果局部像元边界向内移动到像元，则为面积变化分配一个负号。 通过将相邻边界点拟合到一个圆（每侧 5 个;总共 11 个）32 来测量每个框架的每个边界点的局部膜曲率（图 3B）。 使用MATLAB中的imagesc函数（图3D，E）生成kymographs，以显示亚细胞特征随时间的变化，并与细胞的位置相关。