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생물학

Imaging della migrazione dei neutrofili nella pelle del topo per studiare il rimodellamento della membrana subcellulare in condizioni fisiologiche

Published: May 10, 2022
doi:
10.3791/63581
, , ,
1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Center for Cancer Research,National Cancer Institute, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center,UNC-Chapel Hill

Summary

La migrazione dei neutrofili si basa sul rapido e continuo rimodellamento della membrana plasmatica in risposta al chemioattrattivo e alle sue interazioni con il microambiente extracellulare. Qui descritta è una procedura basata sulla microscopia subcellulare intravitale per studiare la dinamica del rimodellamento della membrana nei neutrofili iniettati nell’orecchio di topi anestetizzati.

Abstract

Lo studio del reclutamento e della funzione delle cellule immunitarie nei tessuti è stato un campo molto attivo negli ultimi due decenni. I neutrofili sono tra le prime cellule immunitarie a raggiungere il sito dell’infiammazione e a partecipare alla risposta immunitaria innata durante l’infezione o il danno tissutale. Finora, la migrazione dei neutrofili è stata visualizzata con successo utilizzando vari sistemi sperimentali in vitro basati sulla stimolazione uniforme, o sulla migrazione confinata sotto agarosio o canali microfluidici. Tuttavia, questi modelli non ricapitolano il complesso microambiente che i neutrofili incontrano in vivo. Lo sviluppo di tecniche basate sulla microscopia multifotone (MPM), come la microscopia subcellulare intravitale (ISMic), offre uno strumento unico per visualizzare e studiare la dinamica dei neutrofili a risoluzioni subcellulari in condizioni fisiologiche. In particolare, l’orecchio di un topo anestetizzato vivo fornisce un vantaggio sperimentale per seguire la migrazione interstiziale dei neutrofili in tempo reale grazie alla sua facilità di accessibilità e alla mancanza di esposizione chirurgica. ISMic fornisce la risoluzione ottica, la velocità e la profondità di acquisizione necessarie per tracciare i processi cellulari e, soprattutto, subcellulari in 3D nel tempo (4D). Inoltre, l’imaging multimodale del microambiente interstiziale (cioè vasi sanguigni, cellule residenti, matrice extracellulare) può essere facilmente realizzato utilizzando una combinazione di topi transgenici che esprimono marcatori fluorescenti selezionati, marcatura esogena tramite sonde fluorescenti, fluorescenza intrinseca tissutale e segnali generati da seconda/terza armonica. Questo protocollo descrive 1) la preparazione dei neutrofili per il trasferimento adottivo nell’orecchio del topo, 2) diverse impostazioni per l’imaging subcellulare ottimale, 3) strategie per ridurre al minimo gli artefatti da movimento mantenendo una risposta fisiologica, 4) esempi di rimodellamento di membrana osservati nei neutrofili utilizzando ISMic e 5) un flusso di lavoro per l’analisi quantitativa del rimodellamento di membrana nei neutrofili in migrazione in vivo.

Introduction

La migrazione cellulare diretta è un evento critico che si verifica durante diversi processi fisiologici e patologici, tra cui lo sviluppo, la risposta immunitaria, la riparazione dei tessuti e l’inizio, la progressione e la disseminazione del tumore 1,2. Questo processo si basa su specifici segnali chemiotattici extracellulari rilevati dai loro recettori affini sulla membrana plasmatica e poi trasdotti in intricati segnali intracellulari. Queste vie, a loro volta, attivano la migrazione cellulare attraverso una serie di risposte, tra cui l’attivazione locale del citoscheletro, il traffico e il rimodellamento della membrana e la polarizzazione cellulare3. Due tipi distinti di migrazione cellulare sono stati ben caratterizzati: mesenchimale e ameboide4. La migrazione mesenchimale è relativamente lenta (10 μm/min) e utilizza aderenze deboli per navigare attraverso la MEC. Indipendentemente dalla modalità, la migrazione cellulare richiede un costante rimodellamento della membrana plasmatica con conseguente generazione di strutture sporsive sul bordo anteriore delle cellule, che sono strettamente coordinate con la retrazione della membrana nella parte posteriore1.

Per svelare i meccanismi molecolari alla base di questi processi sub-cellulari, è fondamentale visualizzare la dinamica delle membrane nelle cellule in migrazione ad un’appropriata risoluzione temporale e spaziale. Inoltre, poiché il rimodellamento della membrana è fortemente influenzato dalle proprietà del microambiente tissutale che circonda le cellule migranti, è fondamentale visualizzare questo processo direttamente nel tessuto nativo, all’interno di animali vivi. Ciò si ottiene utilizzando la microscopia intravitale (IVM)5. Il primo imaging IVM è stato eseguito ~ 200 anni fa, quando lo stravaso dei leucociti è stato visualizzato utilizzando un semplice microscopio a trans-illuminazione6 e successivamente l’IVM è stato utilizzato principalmente su organismi modello semitrasparenti, come Zebrafish e Drosophila 7,8. Negli ultimi due decenni, l’IVM è stato utilizzato con successo per studiare i processi cellulari nei topi, nei ratti e nei mammiferi più grandi come i maiali 5,9. Ciò è stato reso possibile grazie a 1) sviluppi significativi nella microscopia confocale e multi-fotone (MP) e 2) all’aumento della tecnologia di editing genetico come CRISPR-Cas9, che ha permesso la rapida ingegnerizzazione di una varietà di modelli animali per esprimere proteine marcate in fluorescenza e reporter. Inoltre, la visualizzazione delle singole cellule e del loro microambiente durante processi come l’inizio del tumore, la migrazione cellulare e la risposta immunitaria è stata resa possibile sia da altre forme di marcature esogene, come l’introduzione sistemica di coloranti per marcare il sistema vascolare10,11, sia dall’eccitazione di molecole endogene, come il collagene attraverso la generazione di seconda armonica (SHG)10. 12 e fibre nervose attraverso la Generazione di Terza Armonica (THG)11,13. Infine, un miglioramento delle tecniche per minimizzare gli artefatti di movimento dovuti al battito cardiaco e alla respirazione ha portato allo sviluppo della microscopia subcellulare intravitale (ISMic), che ha permesso ai ricercatori di visualizzare e studiare diversi eventi subcellulari direttamente in animali vivi a un livello di risoluzione simile a quelli osservati in vitro 14,15,16,17 . Esempi di ISMic includono lo studio della dinamica del citoscheletro durante l’esocitosi 14,15,16,17 e l’endocitosi15, il rimodellamento dinamico del citoscheletro durante la migrazione cellulare17,18, la localizzazione e il metabolismo mitocondriale19,20 e la segnalazione del calcio nel cervello 21.

Questo protocollo descrive in dettaglio i diversi passaggi e procedure per studiare il rimodellamento della membrana cellulare a una risoluzione subcellulare durante la migrazione dei neutrofili nella pelle dell’orecchio di un topo vivo utilizzando ISMic. Questo approccio si basa sui protocolli22,23 precedentemente descritti e viene adattato per ottenere una maggiore risoluzione spaziale e temporale.

Protocol

Tutti gli esperimenti e le procedure sugli animali sono stati approvati dal National Cancer Institute (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) Animal Care and Use Committee (protocolli LCMB-031 e LCMB-035) e sono stati conformi a tutte le normative etiche pertinenti. Per gli esperimenti sono stati utilizzati sia topi maschi che femmine di età compresa tra 2 e 6 mesi. I topi ospiti mT/mG e wild-type (WT) si trovano in uno sfondo FVB/NJ mentre i topi LyzM-Cre x mTmG sono in uno sfondo C57BL/6. 1. Materiali e preparazione dei reagenti e degli strumenti Rivestire tubi, piatti e aghi/siringhe con PBS + 1% BSA (senza calcio e magnesio) durante la notte sotto agitazione. Pulire accuratamente le superfici e gli strumenti/strumenti da utilizzare per il lavoro con gli animali utilizzando etanolo al 70% o in autoclave.Per la purificazione dei neutrofili, preparare quanto segue: 3 provette da 15 mL, 1 piastra da 60 mm, 1 provetta da 1,5 mL; HBSS contenente 10 mM di HEPES (pH 7,3); soluzione di lisi dei globuli rossi (ACK); Histopaque 1077; e Histopaque 1119. Per le iniezioni di neutrofili, preparare quanto segue: 1 siringa a basso volume (10 μL), 1 ago smussato da 33 G, isoflurano e soluzione per anestesia (ketamina, xilazina e acepromazina a 80 mg·kg-1, 2 mg·kg-1 e 4 mg·kg-1, rispettivamente, in soluzione salina). 2. Purificazione dei neutrofili da un topo donatore Sopprimere il topo donatore secondo le normative istituzionali locali. Raccogliere le ossa lunghe dall’animale (femore, tibia e omero), prestando attenzione a preservare l’integrità delle ossa ed evitando di tagliare le teste delle ossa durante la raccolta24. In un piatto da 60 mm rivestito in BSA, rimuovere i muscoli e il tessuto adiposo. Tagliare le teste delle ossa per accedere al midollo, quindi lavare e omogeneizzare il midollo osseo utilizzando una siringa (ago da 27 G) riempita con HBSS. Filtrare la soluzione in una provetta rivestita di BSA da 15 mL utilizzando un filtro da 40 μm e centrifugarla a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Aspirare il surnatante, risospendere il pellet in 1 mL di ACK per 30 s per lisare i globuli rossi, quindi aggiungere 9 mL di HBSS per fermare la lisi. Centrifugare la soluzione a 400 x g per 5 minuti a RT. Preparare un gradiente di densità in una provetta rivestita di BSA da 15 mL posizionando delicatamente 4 mL di 1119 Histopaque sul fondo della provetta, quindi sovrapponendo delicatamente 4 mL di 1077 Histopaque sulla parte superiore. Prestare particolare attenzione per evitare di mescolare i due strati. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di HBSS. Sovrapporre delicatamente la soluzione sopra il gradiente di gradini preparato sopra. Centrifuga a 1.000 x g per 30 minuti a RT con la velocità di accelerazione e decelerazione più bassa possibile (“non è preferibile frenare”). Dalla parte superiore del tubo, aspirare delicatamente metà dello strato di 1077 Histopaque. Raccogli la metà rimanente dello strato 1077 Histopaque e la metà superiore dello strato 1119 Histopaque in un nuovo tubo rivestito di BSA. La sospensione cellulare torbida tra i due strati di densità contiene prevalentemente neutrofili. Aggiungere HBSS per raggiungere un volume finale di 15 mL e mescolare delicatamente capovolgendo la provetta. Centrifugare a 400 x g per 5 min a RT. Dopo la centrifugazione, risospendere e lavare il pellet cellulare con 10 mL di HBSS e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Ripetere la procedura, quindi risospendere il pellet in 15 mL di HBSS per determinare il numero di cellule utilizzando un contatore di cellule. Infine, centrifugare e risospendere le cellule in 1 mL di HBSS e trasferirle in una provetta rivestita di BSA da 1,5 mL. Dopo la purificazione, mantenere la sospensione di neutrofili nella provetta rivestita di BSA sotto leggera agitazione per 30 minuti su un rotatore di provette a RT fino alla marcatura e/o all’iniezione.NOTA: Una purificazione riuscita produce 10-20 x 106 neutrofili per topo con una purezza del 95%. La purezza viene valutata tramite citometria a flusso, utilizzando marcatori neutrofili precedentemente descritti (Ly6G+, Ly6C-, Gr1+ e CD11b+)25,26.NOTA: I protocolli sulla purificazione dei neutrofili dal sangue periferico umano e dal midollo osseo di topo sono disponibili in precedenza24,27. 3. Marcatura dei neutrofili NOTA: Per visualizzare i neutrofili, sono stati purificati da topi LyzM-Cre mT/mG , in cui le cellule mieloidi esprimono un peptide mirato alla membrana fuso con la GFP. Inoltre, i neutrofili purificati di topi wild-type (WT) sono stati marcati in vitro. I passaggi seguenti descrivono la procedura utilizzata per marcare i neutrofili purificati con un colorante fluorescente verde permeabile alle cellule commerciali e possono essere adattati a qualsiasi altra sonda fluorescente compatibile con MPM di scelta. Aggiungere il colorante fluorescente verde (concentrazione consigliata dal produttore; in questo caso, 1 μM) alla sospensione di neutrofili (purificata da topo WT) in una provetta rivestita di BSA da 1,5 mL. Incubare per 30 minuti a RT agitando delicatamente in un rotatore di provette. Lavare tre volte con HBSS, centrifugare a 400 x g per 5 minuti a RT e risospendere il pellet in 1 mL di HBSS. Mantenere la sospensione di neutrofili nella provetta rivestita di BSA sotto leggera agitazione in un rotatore di provette a RT fino alla procedura di iniezione.NOTA: L’iniezione di neutrofili marcati eseguita subito dopo la marcatura è altamente preferibile. Tuttavia, se necessario, i neutrofili marcati possono essere mantenuti sotto agitazione per ulteriori 10-15 minuti dopo la marcatura senza compromettere l’integrità della risposta dei neutrofili in vivo. L’agitazione a lungo termine (più di 60 minuti dopo la marcatura) porterà a aggregazione, morte dei neutrofili e osservazioni fuorvianti in vivo. Poco prima dell’iniezione, risospendere il pellet cellulare in soluzione salina per raggiungere una densità di 2-5 x 106 celle per 20 μl. 4. Iniezione di neutrofili NOTA: L’anestesia deve essere eseguita seguendo le linee guida del Comitato per la cura e l’uso degli animali istituzionali locali. Porre l’animale in una camera chiusa e somministrare isoflurano al 3%-5% (portata di 2 L/min) utilizzando un vaporizzatore calibrato collegato a un concentratore di ossigeno. Valuta se l’animale è incosciente testando il riflesso di ritiro della zampa dopo aver pizzicato il cuscinetto posteriore. Quindi, trasferisci l’animale su un tappetino riscaldante (37° C) per mantenere la sua temperatura corporea. Continuare a somministrare l’isoflurano (1%-2%; portata di 0,5 L/min) attraverso un cono nasale.NOTA DI SICUREZZA: Per limitare l’esposizione del personale all’isoflurano tossico, si raccomanda l’uso di un sistema di erogazione dotato di un’unità di filtraggio per recuperare l’isoflurano circolante. Per ottimizzare la qualità dell’immagine, rimuovere i peli dall’orecchio utilizzando un rifinitore fine. Questa procedura potrebbe anche essere eseguita uno o due giorni prima dell’esperimento.NOTA: L’uso di una crema depilatoria è sconsigliato poiché è noto che esacerba la risposta infiammatoria nella pelle del topo e introduce artefatti di imaging. Posiziona l’animale su un fianco. Usando del nastro chirurgico, tieni il bordo dell’orecchio e appiattiscilo lungo il cuscinetto riscaldante. Applicare delicatamente il nastro per evitare danni all’orecchio. Riempire una siringa dotata di un ago da 33 G con la sospensione neutrofila (2-5 x 106 cellule per 20 μL) e montarla su un micromanipolatore.NOTA: L’angolo di iniezione tra l’ago e l’orecchio su un cuscinetto riscaldante deve essere compreso tra 10° e 30° per ridurre al minimo il danno tissutale e aumentare il successo dell’iniezione cellulare. Muovi delicatamente l’ago (con lo smusso rivolto verso l’alto) verso l’orecchio e perfora lentamente la pelle. Una volta che l’ago è all’interno della pelle, spingere lentamente il pistone ed erogare 2-3 μL di sospensione cellulare.NOTA: Le aree con vasi sanguigni visibili devono essere evitate poiché il danneggiamento di un vaso sanguigno provoca una risposta immunitaria indesiderata e complessa all’iniezione e problemi con l’imaging. Ripetere l’iniezione in 2-3 diverse aree dell’orecchio, preferibilmente a 2-3 mm di distanza. Non “riempire eccessivamente” l’orecchio con la sospensione cellulare.NOTA: L’iniezione deve essere eseguita al centro dell’orecchio. La periferia dell’orecchio è sottile e deve essere maneggiata con cura in quanto può essere facilmente danneggiata, mentre la parte centrale è più spessa e contiene vasi sanguigni più grandi e meno follicoli piliferi e può sopportare volumi di iniezione maggiori. Rimuovere con cautela il nastro chirurgico e lasciare che l’animale riprenda conoscenza sotto supervisione. Lasciare riposare l’animale per 1 ora prima dell’imaging per consentire al tessuto e alle cellule di riprendersi dalla procedura di iniezione. 5. Anestesia per IVM NOTA: Un’anestesia più profonda migliora significativamente la qualità dell’imaging diminuendo gli artefatti di movimento dovuti al battito cardiaco e alla respirazione. I topi iniettati con neutrofili sono sottoposti ad anestesia chimica, che fornisce una sedazione più profonda rispetto all’anestesia indotta da gas. L’anestesia deve essere eseguita seguendo le linee guida del Comitato per la cura e l’uso degli animali dell’istituto locale. Un’ora dopo il recupero dall’iniezione di neutrofili, anestetizzare gli animali mediante un’iniezione sottocutanea contenente una miscela di xilazina/ketamina/acepromazina (rispettivamente 80 mg·kg-1, 2 mg·kg-1 e 4 mg·kg-1) in soluzione salina.NOTA: Per garantire la riproducibilità e l’affidabilità dei risultati, gli animali devono essere mantenuti al caldo dal momento dell’anestesia fino alla fine dell’esperimento utilizzando un termoforo o un cuscinetto di circolazione dell’acqua collegato a una pompa di riscaldamento. Per mantenere l’anestesia oltre 1 ora, iniettare una miscela di ketamina/acepromazina (rispettivamente 40 mg·kg-1 e 2 mg·kg-1 ) per via sottocutanea ogni 40 minuti. Monitorare periodicamente i topi anestetizzati per segni di coscienza testando il riflesso di ritiro della zampa. Inoltre, per le procedure di imaging che durano più di 1 ora, applicare un unguento oftalmico sterile non farmacologico sugli occhi per prevenire l’essiccazione della cornea durante l’anestesia e mantenere l’idratazione del corpo mediante iniezioni sottocutanee di soluzione salina (200 μl ogni ora).NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un sistema basato sulla perfusione a controllo digitale per garantire un’iniezione periodica e regolare della soluzione di anestesia e/o fornire fluidi. È possibile impostare un driver automatico per siringa per erogare il volume di anestetico desiderato e fornire idratazione per periodi più lunghi. A tal fine, un ago per infusione alato può essere inserito per via sottocutanea nella pelle dorsale dell’animale e fissato con nastro chirurgico. 6. Imaging NOTA: La configurazione dell’animale e i parametri di imaging qui descritti sono ottimizzati per un microscopio multifotone invertito dotato di una singola linea laser per eccitare e raccogliere simultaneamente le emissioni dai diversi fluorofori. Prima di posizionare l’animale anestetizzato sul tavolino del microscopio, assicurarsi che il microscopio sia acceso e che sia il tavolino che le lenti siano preriscaldati a 37 °C. Coprire il foro sul palco con un vetrino coprioggetto (spessore #1 o 1,5) allineato con la lente riscaldata. Sposta l’animale sul palco con cautela. Se l’imaging è pianificato per una lunga durata (>1 ora), applicare un unguento oftalmico e fissare il sistema di perfusione alato basato sull’infusione come descritto sopra. Posizionare una goccia di soluzione salina al centro del vetrino coprioggetti e posizionare sopra l’orecchio iniettato con neutrofili. Appiattire delicatamente l’orecchio utilizzando un batuffolo di cotone sterile al centro del vetrino coprioggetti per rimuovere le sacche d’aria.NOTA: L’applicazione di soluzione fisiologica (o PBS) tra l’orecchio e il vetrino coprioggetti riduce la rifrazione della luce dovuta alle sacche d’aria, garantendo così un indice di rifrazione uniforme e una qualità di imaging superiore. Fissare l’orecchio premendo delicatamente un bastoncino di legno (rimosso dal batuffolo di cotone) sul lato dell’orecchio più vicino alla testa dell’animale e bloccandolo con del nastro adesivo (Figura 1A).NOTA: Un bastoncino di legno protetto riduce al minimo gli artefatti di movimento dovuti al battito cardiaco e alla respirazione e aumenta notevolmente la qualità dell’imaging. È importante sottolineare che il bastoncino di legno deve essere fissato quel tanto che basta per stabilizzare l’orecchio senza compromettere il flusso sanguigno. Utilizzando l’oculare del microscopio, trovare un’area di interesse, quindi passare alla modalità di acquisizione multifotone. Impostare la lunghezza d’onda di eccitazione del laser su 900-930 nm per consentire l’acquisizione simultanea di colorante fluorescente GFP/verde, mTomato e collagene-I (tramite SHG). Impostare un set appropriato di specchi e combinazioni di filtri sui rivelatori per raccogliere la luce emessa (filtri passa-banda: Blu = 410-460 nm, Verde = 495-540 nm, Rosso = 580-640 nm).NOTA: I neutrofili iniettati, quando marcati con un colorante fluorescente verde, mostrano una forte fluorescenza verde che li rende visibili sotto l’oculare del microscopio anche se iniettati in porzioni più profonde dell’orecchio. Determinare l’impostazione più appropriata per la configurazione hardware. Anche se le cellule in migrazione possono essere tracciate con un intervallo da 30 s a 1 minuto, visualizzare gli eventi subcellulari con una velocità maggiore (almeno <10 s di intervallo). Nell'esempio seguente, vengono presentate due diverse configurazioni di imaging per mostrare la differenza tra IVM classico e ISMic.Nell’approccio IVM classico per tracciare la migrazione cellulare e studiare il tessuto del topo ospite (Figura 1), utilizzare una lente 30x e uno scanner galvo con una dimensione dell’immagine di 512 x 512 pixel (dimensione dei pixel di 0,83 μm) e impostare lo spostamento dell’asse z utilizzando lo stadio motorizzato con una dimensione del passo di 2 μm, consentendo l’imaging di un volume profondo di 30 μm ogni 30 s. Nell’approccio ISMic per l’immagine di un rimodellamento della membrana altamente dinamico a un ingrandimento e una risoluzione più elevati (Figura 2), utilizzare una lente 40x e uno scanner risonante con media 3x e dimensione dell’immagine di 512 x 512 pixel (dimensione dei pixel di 0,25 μm) e impostare lo spostamento dell’asse z utilizzando un piezo con una dimensione del passo di 1 μm, consentendo l’imaging di un volume profondo di 20 μm ogni 4-5 s. Innescare la migrazione dei neutrofili inducendo una lesione laser sterile. Focalizzare il laser di eccitazione ad una potenza elevata sufficiente a raggiungere almeno 80 mW22, su un’area ristretta del tessuto (20 μm x 20 μm) per 10 s. Identificare la lesione indotta dal laser dai suoi forti segnali autofluorescenti che appaiono in tutti i canali e dalla conseguente alterazione della disposizione del collagene (Figura 1D).NOTA: Per ottenere risultati affidabili, la lesione deve essere sempre indotta il più lontano possibile dai vasi sanguigni; In caso di rottura, le cellule del sangue rilasciate nel tessuto influenzeranno la qualità dell’imaging e provocheranno una forte reazione immunitaria complessiva. Salvare i dati al termine della sperimentazione per ulteriori analisi. Sopprimere l’animale secondo le linee guida istituzionali locali. Se necessario, il tessuto può essere raccolto per il fissaggio e l’ulteriore elaborazione. 7. Analisi rappresentativa dei dati NOTA: I dati possono essere visualizzati e analizzati con il software del microscopio, con software di terze parti o con programmi personalizzati. La procedura e gli strumenti utilizzati dipendono dalle esigenze specifiche degli investigatori. Di seguito è mostrato un esempio di flusso di lavoro per quantificare la curvatura della membrana e i cambiamenti dell’area locale sul bordo anteriore e sul retro dei neutrofili in migrazione. Apri i file di imaging con Imaris o Fiji per visualizzare la migrazione dei neutrofili in 4D e determinare la qualità dell’esperimento.NOTA: Imaris e Fiji possono leggere il formato di imaging di diverse marche di microscopi. Elabora i dati con i seguenti passaggi eseguendo script di codice MATLAB personalizzati. Leggete i file di imaging selezionati con il pacchetto Bio-Formats28 per MATLAB. Segmenta ogni fotogramma del volume 3D con l’algoritmo Otsu29 per identificare le singole celle. Tracciare gli oggetti identificati in base al criterio di spostamento minimo30. Determina i contorni e i contorni attivi dell’oggetto.Genera una proiezione massima per ogni oggetto identificato in un intervallo di tempo. Applica la funzione bwboundaries in MATLAB alla max-projection di ogni oggetto identificato dal passaggio 7.2 per generare 100 punti limite. Ottimizza i punti di confine identificati con l’algoritmo di contorno dinamico per ottenere una precisione subpixel31 (Figura 3A) utilizzando le funzioni del pacchetto MATLAB scaricato tramite http://www.iacl.ece.jhu.edu/static/gvf/. Sovrapporre i contorni dell’oggetto e l’indice di traiettoria dell’oggetto determinato dal tracciamento nel passaggio 7.3 con la proiezione massima dell’immagine originale per generare un output di un filmato 2D sovrapposto per la visualizzazione e il controllo manuale. Nel filmato sovrapposto, selezionate manualmente tutti gli oggetti identificati come celle in migrazione escludendo gli oggetti non celle, gli oggetti che toccano e gli oggetti con bordi incompleti. Registra gli indici di tracciamento, i fotogrammi di inizio e fine di ogni traiettoria di cella in un foglio di calcolo da utilizzare come input per i passaggi successivi implementati dagli script di codice MATLAB. Tracciate i punti di confine delle celle da ogni fotogramma a quello successivo in base al criterio di spostamento minimo. Utilizza la funzione Polyarea in MATLAB per calcolare l’area sottolineata da punti di confine adiacenti in due intervalli di tempo consecutivi (Figura 3C). Se il contorno della cella locale si sposta verso l’esterno della cella, assegnare un segno positivo alla modifica dell’area. Se il contorno della cella locale si sposta verso l’interno della cella, assegnare un segno negativo alla modifica dell’area. Misurare la curvatura della membrana locale in ogni punto di confine per ogni fotogramma adattando i punti di confine adiacenti a un cerchio (5 per lato; totale 11)32 (Figura 3B). Genera chimografi utilizzando la funzione imagesc in MATLAB (Figure 3D, E) per mostrare i cambiamenti delle caratteristiche subcellulari nel tempo e correlare alla posizione della cellula.

Representative Results

Qui, vengono presentati due diversi set di risultati per illustrare l’IVM classico e l’ISMic che forniscono rispettivamente una risoluzione cellulare e sub-cellulare. Nel primo esempio, i neutrofili sono stati purificati da un topo wild-type (WT), marcati con Cell Tracker Green per colorare il citoplasma e iniettati in un topo transgenico che esprime una proteina fluorescente che ha come bersaglio la membrana plasmatica (topo mTomato, noto anche come mT/mG33, Figura 1 e Movie 1 e Movie 2). Questo topo ricevente ha permesso la visualizzazione delle caratteristiche strutturali del tessuto dell’orecchio come i vasi sanguigni, le cellule residenti e i follicoli piliferi (Figura 1C e Filmato 1) tramite un approccio basato su IVM (passaggio 6.8.1). Le fibre di collagene, rivelate tramite SHG (rilevate a metà della lunghezza d’onda dell’eccitazione), erano disposte in una rete intricata nel derma, dove venivano iniettati i neutrofili. Lungo il bordo dei follicoli piliferi (HF), è stato osservato uno strato di cellule epiteliali (cioè cheratinociti). Occasionalmente, sono stati visualizzati artefatti da peli residui con conseguente depressione locale della pelle (H). Le lesioni indotte dal laser sono state facilmente visualizzate grazie alla loro forte autofluorescenza rilevata in tutti i canali e alle alterazioni della disposizione del collagene (Figura 1D). Una visione più completa dell’architettura 3D della pelle e della localizzazione dei neutrofili iniettati può essere apprezzata nel filmato 1, che ritrae una pila Z della pelle dagli strati esterni a quelli interni e un rendering del volume 3D. L’imaging time-lapse ha mostrato che i neutrofili campionavano la pelle dell’orecchio e interagivano con la ECM e il tessuto ospite (Filmato 2). L’imaging a questa risoluzione e l’acquisizione di uno stack Z ogni 30 s consentono di eseguire il tracciamento cellulare e la misurazione dei parametri di motilità (cioè velocità e direzionalità), ma un’analisi precisa e dettagliata del rimodellamento della membrana è impegnativa a questa risoluzione. Nel secondo esempio, il rimodellamento della membrana è stato valutato tramite l’approccio ISMic (passaggio 6.8.2) utilizzando neutrofili che esprimono mGFP purificati da topi LyzM-cre mT/mG e iniettati in animali WT (Figura 2A, diagramma di flusso sperimentale). Utilizzando il protocollo ISMic (Filmato 3 e immagini fisse nella Figura 2B) e in caso di lesione laser, si osserva un rimodellamento dinamico della membrana plasmatica durante la migrazione e la formazione di sporgenze di membrana sul bordo anteriore e la retrazione della parte posteriore delle cellule sono chiaramente visualizzate (Figura 2 e Filmato 3). Le sequenze time-lapse evidenziate nel filmato 3 rivelano la complessità delle interazioni con l’ECM. Infatti, i neutrofili migravano attraverso lo spazio interstiziale muovendosi lungo le fibre o negli spazi tra di loro. Infine, per ogni punto temporale sono stati quantificati aspetti quantitativi come i cambiamenti di curvatura e i cambiamenti di area nella parte anteriore e posteriore delle celle. Utilizzando la cellula descritta nella Figura 2B come esempio, la dinamica locale della membrana plasmatica è stata analizzata utilizzando una pipeline di algoritmi (vedi passaggio 7) basata sull’identificazione di 100 punti di confine sottostanti la superficie cellulare (Figura 3A). Le variazioni della curvatura locale (Figura 3B) e dell’area sottolineata dalle sporgenze della membrana plasmatica (Figura 3C) sono state calcolate per ogni punto di confine e riportate per ogni intervallo di tempo come chimografi (Figura 3D, E). Sia la parte anteriore che quella posteriore delle celle mantengono una curvatura maggiore rispetto al lato delle celle (Figura 3D); Le variazioni negative dell’area (retrazioni, regioni blu) sono più evidenti nella parte posteriore delle celle che sul bordo anteriore, dove le variazioni positive dell’area sono più evidenti (sporgenze, regioni rosse) (Figura 3E). Figura 1: IVM dei neutrofili nella pelle dell’orecchio del topo. (A) Disegno schematico dell’impostazione dell’orecchio sul tavolino del microscopio. (B) Diagramma di flusso sperimentale. (C) Immagine rappresentativa della pelle dell’orecchio di un topo mTomato iniettato con neutrofili marcati in fluorescenza, con diverse proiezioni. Follicolo pilifero (HF), vaso sanguigno (BV), epidermide (E), derma (D), strato di cellule basali (BCL) e artefatto dei capelli (a causa di un residuo di peli sulla superficie della pelle, H). (D) Immagine rappresentativa della pelle del topo dopo una lesione laser sterile: canale blu (a destra), canali verdi e rossi (al centro), immagine unita (a sinistra). La lesione è visibile a sinistra dell’immagine da una forte emissione di autofluorescenza in entrambi i canali verde e rosso, nonché da una rottura della ECM osservata dalla formazione di un foro nelle fibre di collagene-I. In C e D, Verde: neutrofili; Rosso: tessuto ospite di topo; Ciano: Collagene-I SHG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Time-lapse della migrazione del neutrofilo mGFP in un orecchio di topo WT. (A) Diagramma di flusso sperimentale. (B) Immagini fisse rappresentative del filmato 3. (C) Rendering del volume della stessa cella per visualizzare l’organizzazione 3D della membrana. L’area dell’alta dinamica della membrana è illustrata da una freccia (rossa per la retrazione e blu per la protrusione). (D) Visualizzazione ravvicinata e inclinata del volume della cella renderizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Pipeline di analisi per la quantificazione della dinamica di membrana raccolta utilizzando ISMic. (A) Determinazione del contorno cellulare e ripartizione dei punti di confine (100 punti di confine) tra due frame consecutivi per il neutrofilo mGFP descritto nella Figura 2B. (B) I contorni colorati rappresentano la curvatura locale della membrana determinata per ogni punto di contorno. (C) L’area locale cambia tra due fotogrammi consecutivi (corrente: blu e successivo: rosso). Le aree verdi rappresentano i risultati di tracciamento del movimento locale della membrana. Le frecce gialle indicano la direzione generale dello spostamento della membrana. (D) Chimografo della curvatura al contorno della cella nel tempo. L’asse verticale rappresenta gli indici dei punti di contorno, dove 1 e 100 rappresentano la parte posteriore della cella in base alla sua direzione di migrazione. (E) Chimografo a cambiamento di area locale che riflette la sporgenza della membrana (rosso) e la retrazione della membrana (blu) della cellula nel tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Filmato 1: Neutrofili marcati in verde visualizzati in un orecchio di topo mTomato utilizzando IVM. Rosso: tessuto di topo ospite mTomato. Ciano: Collagene-I SHG; Verde: neutrofilo. Clicca qui per scaricare questo filmato. Filmato 2: IVM di neutrofili che migrano nella pelle dell’orecchio di un topo mTomato. I video sono proiezioni di massima intensità di una pila di immagini acquisite per ͂27 min con un frame rate di 5 fotogrammi/s. Rosso: tessuto di topo ospite mTomato. Ciano: Collagene-I SHG; Verde: neutrofilo. Clicca qui per scaricare questo filmato. Filmato 3: ISMic del rimodellamento della membrana durante la migrazione dei neutrofili in un orecchio di topo WT. I video sono proiezioni di massima intensità di una pila di immagini acquisite per ͂8 min con una frequenza fotogrammi di 10 fotogrammi/s. Rosso: tessuto di topo ospite mTomato. Ciano: Collagene-I SHG; Verde: neutrofilo mGFP; Verde chiaro: neutrofilo reso. Clicca qui per scaricare questo filmato.

Discussion

Nonostante decenni di progressi nel campo della migrazione cellulare e del rimodellamento della membrana, pochissimi studi hanno impiegato l’IVM per visualizzare le caratteristiche subcellulari negli animali vivi. Le procedure descritte in questo protocollo forniscono un potente strumento per ottenere nuove informazioni sulla migrazione dei neutrofili negli animali vivi e più specificamente sul rimodellamento della membrana plasmatica durante questo processo. Questo approccio rende possibile studiare la migrazione dei neutrofili in condizioni fisiologiche considerando la complessità intrinseca del microambiente tissutale. Infatti, l’uso del MPM consente la visualizzazione di molteplici caratteristiche all’interno del tessuto ospite utilizzando una combinazione di ceppi murini che esprimono marcatori fluorescenti selezionati, marcatura di tessuti esogeni, eccitazione della fluorescenza endogena e segnali generati attraverso SHG o THG 12,13.

Un potenziale problema da considerare in questa procedura è il fotodanneggiamento. Anche se il MPM è generalmente più sicuro della microscopia confocale per quanto riguarda il fotosbiancamento e la fototossicità, è necessario prestare attenzione quando si esegue l’imaging di tessuti vivi34. La fototossicità può ostacolare drasticamente i risultati creando artefatti di imaging che vanno da piccole macchie luminose ad aree più grandi di tessuto danneggiato o inibendo/stimolando una varietà di percorsi intracellulari. Per prevenire la fototossicità, la potenza del laser deve essere ridotta al minimo e devono essere progettati controlli appropriati per verificare che le condizioni fisiologiche siano mantenute (ad esempio, misurazione del flusso sanguigno, sonde per lo stress ossidativo)35,36. Inoltre, in questa specifica procedura, che coinvolge la pelle, i ceppi albini sono altamente raccomandati in quanto la melanina presente negli animali a pelo scuro è più sensibile alla fototossicità 36,37,38.

Tra i principali limiti della procedura ci sono il sistema di microscopio utilizzato e la natura dei neutrofili. Sebbene l’uso del MPM aumenti significativamente la profondità dell’imaging tissutale rispetto ad altre tecniche di microscopia ottica (ad esempio, confocale, disco rotante), la capacità di visualizzare le dinamiche subcellulari nell’orecchio è limitata agli strati più esterni del tessuto (80-100 μm). Ciò è dovuto all’intensa dispersione della luce prodotta dallo spesso strato ECM, che rende difficile studiare la migrazione negli strati più profondi. Un’altra limitazione è il fatto che i neutrofili hanno una vita molto breve e non possono essere conservati in coltura abbastanza a lungo per eseguire tecniche di editing genetico. Questo può essere superato ingegnerizzando i topi per produrre neutrofili privi di geni specifici o che ospitano mutazioni selezionate, il che ovviamente aumenta i costi e la durata della ricerca.

Le procedure qui descritte, sebbene progettate per studiare la dinamica della membrana, possono essere adattate per affrontare qualsiasi problema biologico cellulare non solo nei neutrofili ma anche in altri tipi di cellule immunitarie e cellule migratorie. Le informazioni raccolte attraverso l’IVM a basso ingrandimento sui comportamenti cellulari (ad esempio, fenotipo migratorio, velocità cellulare e direzionalità22) possono essere integrate e correlate con le informazioni meccanicistiche acquisite attraverso ISMic sul riposizionamento degli organelli, la secrezione proteica, l’endocitosi, la dinamica nucleare, la dinamica del calcio, l’organizzazione del citoscheletro e la netosi. L’uso di manipolazioni farmacologiche e/o genetiche può evidenziare il ruolo di specifiche vie molecolari nel processo di interesse, rendendo questo approccio unico e molto potente.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata supportata dal programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.

Materials

1.5 mL tubes USA Scientific 4036-3204
15 mL tubes Corning 430766
1 mL syringe Covidien 8881501400
27 G needle Kendall 827112
27 G winged infusion set Terumo SV*27EL
30x objective Olympus UPLSAPO30XS 1.05 NA, silicon oil immersion
40x objective Olympus UPLSAPO40XS 1.23 NA, silicon oil immersion
60 mm dishes Falcon 353002
6 mL syringe Kendall 8881516937
Acepromazine (10 mg/mL) Vet one 13985-587-50
ACK lysis buffer Quality Biological 118-156-101
Balance AND EK-1200A
BSA Sigma Aldrich A9647
Cell strainer 40 µm Sigma Aldrich CLS431750
Fiji ImageJ N/A Image visualization/analysis software
Fluoview Software Olympus N/A Acquisition software
FVB mouse strain Jackson N/A FVB background
Gas Anesthesia system Patterson veterinary 07-8915712 Link 7 model
Green Cell tracker Thermo C2925 Solubilized in cell culture grade DMSO to reach 1 mM concentration (1000x)
Hair removal cream Nair N/A
HBSS (w/o Ca2+, Mg2+) Gibco 14175-095
HEPES 1 M pH 7.3 Quality Biological 118-089-721
Histopaque 1077 Sigma Aldrich 10771-100ML
Histopaque 1991 Sigma Aldrich 11191-100ML
Imaris Bitplane N/A Image visualization/analysis software
Isoflurane Vet one 13985-528-40
Ketamine (100 mg/mL) Vet one 13985-584-10
LyzM-cre x mT/mG generated in the lab N/A C57BL/6J background
Manual micromanipulator WPI M3301R
MATLAB MatWorks N/A Analysis software
mtomato mouse strain generated in the lab N/A mT/mG, FVB background
Multiphoton laser Spectra Physics Insight DS+
Multiphoton Microscope Olympus MPE-RS
Nanofil 10 µL syringe WPI NANOFIL
Nanofil 33 G needle WPI NF33BV-2
Objective heater Bioptechs N/A
Objective heater controller Bioptechs 150803
Ophtalmic ointment Major NDC 0904-6488-38
Oxygen concentrator Caire VisionAire 5
PBS (w/o Ca2+, Mg2+) Quality Biological 114-058-131
Saline Quality Biological 114-055-101
Stage heater Okolab N/A
Stage heater controller Okolab H401-T
Surgical tape 3M 1538-1 Hypoallergenic
Syringe driver Harvard Apparatus PHD Ultra
Warming Pads Parkland Scientific A2789B
Warming Pump Parkland Scientific TP-700
Xylazine (100 mg/mL) Vet one 13985-704-10
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References

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Melis, N., Subramanian, B., Chen, D., Weigert, R. Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (183), e63581, doi:10.3791/63581 (2022).
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