Imagerie de la migration des neutrophiles dans la peau de souris pour étudier le remodelage de la membrane subcellulaire dans des conditions physiologiques

Toutes les expériences et procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux du National Cancer Institute (National Institutes of Health, Bethesda, MD, États-Unis) (protocoles LCMB-031 et LCMB-035) et étaient conformes à toutes les réglementations éthiques pertinentes. Des souris mâles et femelles âgées de 2 à 6 mois ont été utilisées pour les expériences. Les souris hôtes mT/mG et de type sauvage (WT) sont en arrière-plan FVB/NJ tandis que les souris LyzM-Cre x mTmG sont en arrière-plan C57BL/6. 1. Matériaux et préparation des réactifs et des outils Enduire les tubes, les plats et les aiguilles/seringues avec du PBS + 1% BSA (sans calcium ni magnésium) pendant la nuit sous agitation. Nettoyez soigneusement les surfaces et les outils/instruments à utiliser pour le travail des animaux en utilisant de l’éthanol à 70 % ou en autoclavage.Pour la purification des neutrophiles, préparez ce qui suit : 3 tubes de 15 ml, 1 plat de 60 mm, 1 tube de 1,5 ml ; HBSS contenant 10 mM d’HEPES (pH 7,3) ; solution de lyse des globules rouges (ACK) ; Histopaque 1077 ; et Histopaque 1119. Pour les injections de neutrophiles, préparez ce qui suit : 1 seringue à faible volume (10 μL), 1 aiguille biseautée de 33 G, de l’isoflurane et une solution d’anesthésie (kétamine, xylazine et acépromazine à 80 mg·kg-1, 2 mg·kg-1 et 4 mg·kg-1, respectivement, dans une solution saline). 2. Purification des neutrophiles d’une souris donneuse Euthanasier la souris donneuse conformément aux réglementations institutionnelles locales. Prélevez les os longs de l’animal (fémur, tibia et humérus), en veillant à préserver l’intégrité des os et en évitant de couper la tête des os lorsdu prélèvement. Dans une boîte de 60 mm recouverte d’un BSA, retirez les muscles et les tissus adipeux. Coupez la tête des os pour accéder à la moelle, puis rincez et homogénéisez la moelle osseuse à l’aide d’une seringue (aiguille de 27 G) remplie de HBSS. Filtrer la solution dans un tube de 15 mL revêtu d’un BSA à l’aide d’une crépine de 40 μm et la centrifuger à 400 x g pendant 5 min à température ambiante (RT). Aspirez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 1 mL d’ACK pendant 30 s pour lyser les globules rouges, puis ajoutez 9 mL de HBSS pour arrêter la lyse. Centrifuger la solution à 400 x g pendant 5 min à RT. Préparez un gradient de densité dans un tube de 15 mL revêtu d’un BSA en plaçant délicatement 4 mL de 1119 Histopaque au bas du tube, puis en superposant doucement 4 mL de 1077 Histopaque sur le dessus. Faites très attention à ne pas mélanger les deux couches. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 2 mL de HBSS. Superposez doucement la solution sur le gradient de marche préparé ci-dessus. Tournez à 1 000 x g pendant 30 min à RT avec la vitesse d’accélération et de décélération la plus basse possible (« pas de frein » est préférable). À partir du haut du tube, aspirez doucement la moitié de la couche 1077 Histopaque. Récupérez la moitié restante de la couche 1077 Histopaque et la moitié supérieure de la couche 1119 Histopaque dans un tube frais recouvert de BSA. La suspension cellulaire trouble entre les deux couches de densité contient principalement des neutrophiles. Ajouter HBSS pour atteindre un volume final de 15 mL et mélanger doucement en inversant le tube. Essorage à 400 x g pendant 5 min à RT. Après la centrifugation, remettre en suspension et laver la pastille cellulaire avec 10 mL de HBSS et l’essorer à 400 x g pendant 5 min à température ambiante. Répétez la procédure, puis mettez la pastille en suspension dans 15 mL de HBSS pour déterminer le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Enfin, faites tourner et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de HBSS et transférez-les dans un tube de 1,5 mL revêtu de BSA. Après la purification, maintenir la suspension de neutrophiles dans le tube revêtu de BSA sous une légère agitation pendant 30 min sur un rotateur de tube à RT jusqu’au marquage et/ou à l’injection.REMARQUE : Une purification réussie donne 10-20 x 106 neutrophiles par souris avec une pureté de 95%. La pureté est évaluée par cytométrie en flux, à l’aide de marqueurs neutrophiles décrits précédemment (Ly6G+, Ly6C-, Gr1+ et CD11b+)25,26.REMARQUE : Des protocoles sur la purification des neutrophiles à partir du sang périphérique humain et de la moelle osseuse de souris sont disponibles précédemment24,27. 3. Marquage des neutrophiles REMARQUE : Pour visualiser les neutrophiles, ils ont été purifiés à partir de souris LyzM-Cre mT/mG , chez lesquelles les cellules myéloïdes expriment un peptide ciblé sur la membrane fusionné avec la GFP. De plus, des neutrophiles purifiés de souris de type sauvage (WT) ont été marqués in vitro. Les étapes suivantes décrivent la procédure utilisée pour marquer les neutrophiles purifiés avec un colorant fluorescent vert perméable aux cellules commercial et peuvent être adaptées à toute autre sonde fluorescente compatible MPM de votre choix. Ajouter le colorant fluorescent vert (concentration recommandée par le fabricant ; ici, 1 μM) à la suspension de neutrophiles (purifiée à partir d’une souris WT) dans un tube de 1,5 mL recouvert de BSA. Incuber pendant 30 min à RT sous une légère agitation dans un rotateur de tube. Laver trois fois avec du HBSS, essorer à 400 x g pendant 5 min à RT et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de HBSS. Maintenir la suspension de neutrophiles dans le tube revêtu de BSA sous une légère agitation dans un rotateur de tube à RT jusqu’à la procédure d’injection.REMARQUE : L’injection de neutrophiles marqués effectuée juste après le marquage est fortement préférée. Cependant, si nécessaire, les neutrophiles marqués peuvent être maintenus sous agitation pendant 10 à 15 minutes supplémentaires après le marquage sans compromettre l’intégrité de la réponse des neutrophiles in vivo. L’agitation à long terme (plus de 60 minutes après l’étiquetage) entraînera l’agglutination, la mort des neutrophiles et des observations trompeuses in vivo. Juste avant l’injection, remettre en suspension la pastille cellulaire dans une solution saline pour atteindre une densité de 2-5 x 106 cellules par 20 μL. 4. Injection de neutrophiles REMARQUE : L’anesthésie doit être effectuée conformément aux directives du comité local de soin et d’utilisation des animaux. Placez l’animal dans une chambre fermée et administrez 3 % à 5 % d’isoflurane (débit de 2 L/min) à l’aide d’un vaporisateur calibré relié à un concentrateur d’oxygène. Évaluez si l’animal est inconscient en testant le réflexe de retrait de la patte lors du pincement de la patte arrière. Ensuite, transférez l’animal dans un coussin chauffant (37° C) pour maintenir sa température corporelle. Continuer à administrer l’isoflurane (1 % à 2 % ; débit de 0,5 L/min) par un cône nasal.NOTE DE SÉCURITÉ : Pour limiter l’exposition du personnel à l’isoflurane toxique, il est recommandé d’utiliser un système de distribution équipé d’une unité de filtrage pour récupérer l’isoflurane en circulation. Pour optimiser la qualité de l’imagerie, retirez les poils de l’oreille à l’aide d’une tondeuse fine. Cette procédure pourrait également être effectuée un jour ou deux avant l’expérience.REMARQUE : L’utilisation de crème dépilatoire est déconseillée car elle est connue pour exacerber la réponse inflammatoire dans la peau de la souris et introduire des artefacts d’imagerie. Placez l’animal sur le côté. À l’aide de ruban chirurgical, tenez le bord de l’oreille et aplatissez-le le long du coussin chauffant. Appliquez délicatement le ruban adhésif pour éviter d’endommager l’oreille. Remplissez une seringue équipée d’une aiguille de 33 G avec la suspension neutrophile (2-5 x 106 cellules par 20 μL) et montez-la sur un micromanipulateur.REMARQUE : L’angle d’injection entre l’aiguille et l’oreille sur un coussin chauffant doit être compris entre 10° et 30° pour minimiser les lésions tissulaires et augmenter le succès de l’injection cellulaire. Déplacez doucement l’aiguille (avec le biseau vers le haut) vers l’oreille et percez lentement la peau. Une fois que l’aiguille est à l’intérieur de la peau, poussez lentement le piston et délivrez 2 à 3 μL de suspension cellulaire.REMARQUE : Les zones avec des vaisseaux sanguins visibles doivent être évitées car endommager un vaisseau sanguin entraîne une réponse immunitaire indésirable et complexe à l’injection et des problèmes d’imagerie. Répétez l’injection dans 2-3 zones différentes de l’oreille, de préférence à 2-3 mm de distance. Ne « remplissez » pas l’oreille avec la suspension cellulaire.REMARQUE : L’injection doit être effectuée au centre de l’oreille. La périphérie de l’oreille est mince et doit être manipulée avec précaution car elle peut être facilement endommagée, tandis que la partie centrale est plus épaisse et contient des vaisseaux sanguins plus gros et moins de follicules pileux, et peut supporter de plus grands volumes d’injection. Retirez soigneusement le ruban chirurgical et laissez l’animal reprendre conscience sous surveillance. Laissez l’animal se reposer pendant 1 h avant l’imagerie pour permettre aux tissus et aux cellules de récupérer de la procédure d’injection. 5. Anesthésie pour la MIV REMARQUE : Une anesthésie plus profonde améliore considérablement la qualité de l’imagerie en diminuant les artefacts de mouvement dus au rythme cardiaque et à la respiration. Les souris injectées de neutrophiles sont soumises à une anesthésie chimique, qui fournit une sédation plus profonde que l’anesthésie induite par les gaz. L’anesthésie doit être effectuée conformément aux directives du comité local de protection et d’utilisation des animaux. Une heure après la guérison de l’injection de neutrophiles, anesthésier les animaux par une injection sous-cutanée contenant un mélange de xylazine/kétamine/acépromazine (80 mg·kg-1, 2 mg·kg-1 et 4 mg·kg-1, respectivement) dans une solution saline.REMARQUE : Pour assurer la reproductibilité et la fiabilité des résultats, les animaux doivent être maintenus au chaud depuis le moment de l’anesthésie jusqu’à la fin de l’expérience à l’aide d’un coussin chauffant ou d’un coussin de circulation d’eau relié à une pompe de réchauffement. Pour maintenir l’anesthésie au-delà de 1 h, injecter un mélange de kétamine/acépromazine (40 mg·kg-1 et 2 mg·kg-1 respectivement) par voie sous-cutanée toutes les 40 min. Surveillez périodiquement les souris anesthésiées pour détecter des signes de conscience en testant le réflexe de retrait de la patte. De plus, pour les procédures d’imagerie d’une durée supérieure à 1 h, appliquez une pommade ophtalmique stérile non médicamenteuse sur les yeux pour prévenir le dessèchement de la cornée pendant l’anesthésie et maintenir l’hydratation du corps par des injections sous-cutanées de solution saline (200 μL toutes les heures).REMARQUE : Alternativement, un système basé sur la perfusion à commande numérique peut être utilisé pour assurer une injection périodique et régulière de la solution d’anesthésie et/ou fournir des liquides. Un pousse-seringue automatisé peut être configuré pour administrer le volume souhaité d’anesthésique et fournir une hydratation pendant de plus longues périodes. À cette fin, une aiguille de perfusion ailée peut être insérée par voie sous-cutanée dans la peau dorsale de l’animal et fixée avec du ruban chirurgical. 6. Imagerie REMARQUE : La configuration de l’animal et les paramètres d’imagerie décrits ici sont optimisés pour un microscope multiphotonique inversé équipé d’une seule ligne laser pour exciter et collecter simultanément les émissions des différents fluorophores. Avant de placer l’animal anesthésié sur la platine du microscope, assurez-vous que le microscope est allumé et que la platine et les lentilles sont préchauffées à 37 °C. Couvrez le trou sur la platine avec une lamelle en verre (épaisseur #1 ou 1,5) alignée avec la lentille chauffée. Déplacez l’animal sur la scène avec précaution. Si l’imagerie est prévue pour une longue durée (>1 h), appliquez une pommade ophtalmique et fixez le système de perfusion à ailettes comme décrit ci-dessus. Placez une goutte de solution saline au centre de la lamelle et placez l’oreille injectée de neutrophiles par-dessus. Aplatissez doucement l’oreille à l’aide d’un coton-tige stérile au centre de la lamelle pour éliminer les poches d’air.REMARQUE : L’application de solution saline (ou PBS) entre l’oreille et la lamelle réduit la réfraction de la lumière due aux poches d’air, assurant ainsi un indice de réfraction uniforme et une qualité d’image supérieure. Fixez l’oreille en appuyant doucement un bâton en bois (retiré du coton-tige) sur le côté de l’oreille le plus près de la tête de l’animal et en le verrouillant à l’aide de ruban adhésif (figure 1A).REMARQUE : Un bâton en bois sécurisé minimise les artefacts de mouvement dus au rythme cardiaque et à la respiration et augmente considérablement la qualité de l’image. Il est important de noter que le bâton en bois doit être fixé juste assez pour stabiliser l’oreille sans nuire à la circulation sanguine. À l’aide de l’oculaire du microscope, trouvez une zone d’intérêt, puis passez en mode d’acquisition multiphotonique. Réglez la longueur d’onde d’excitation laser sur 900-930 nm pour permettre l’acquisition simultanée du colorant fluorescent GFP/vert, du mTomato ainsi que du collagène-I (via SHG). Réglez un ensemble approprié de miroirs et une combinaison de filtres sur les détecteurs pour collecter la lumière émise (filtres passe-bande : Bleu = 410-460 nm, Vert = 495-540 nm, Rouge = 580-640 nm).REMARQUE : Les neutrophiles injectés, lorsqu’ils sont marqués avec un colorant fluorescent vert, présentent une forte fluorescence verte qui les rend visibles sous l’oculaire du microscope même s’ils sont injectés dans des parties plus profondes de l’oreille. Déterminez le paramètre le plus approprié à la configuration matérielle. Même si les cellules migratrices peuvent être suivies avec un intervalle de 30 s à 1 min, imagez les événements subcellulaires avec une vitesse plus élevée (intervalle d’au moins <10 s). Dans l’exemple ci-dessous, deux configurations d’imagerie différentes sont présentées pour montrer la différence entre l’IVM classique et l’ISMic.Dans l’approche classique de la GIV pour suivre la migration cellulaire et étudier le tissu de la souris hôte (Figure 1), utilisez un objectif 30x et un scanner galvo d’une taille d’image de 512 x 512 pixels (taille de pixel de 0,83 μm), et réglez le déplacement de l’axe z à l’aide de la platine motorisée avec une taille de pas de 2 μm, permettant d’imager un volume de 30 μm de profondeur toutes les 30 s. Dans l’approche ISMic pour imager un remodelage membranaire hautement dynamique à un grossissement et une résolution plus élevés (Figure 2), utilisez un objectif 40x et un scanner résonant avec une moyenne 3x et une taille d’image de 512 x 512 pixels (taille de pixel de 0,25 μm), et réglez le déplacement de l’axe z à l’aide d’un piézo avec une taille de pas de 1 μm, permettant l’imagerie d’un volume de 20 μm de profondeur toutes les 4-5 s. Déclencher la migration des neutrophiles en induisant une lésion laser stérile. Focaliser le laser d’excitation à une puissance élevée suffisante pour atteindre au moins 80 mW22, sur une zone étroite du tissu (20 μm x 20 μm) pendant 10 s. Identifiez la lésion induite par le laser par ses puissants signaux auto-fluorescents apparaissant dans tous les canaux et par l’altération de l’arrangement du collagène qui en résulte (Figure 1D).REMARQUE : Pour obtenir des résultats fiables, la blessure doit toujours être induite aussi loin que possible des vaisseaux sanguins ; En cas de rupture, les cellules sanguines libérées dans le tissu auront un impact sur la qualité de l’imagerie et entraîneront une forte réaction immunitaire globale. Enregistrez les données à la fin de l’expérimentation pour des analyses plus approfondies. Euthanasier l’animal selon les directives de l’établissement local. Si nécessaire, des tissus peuvent être collectés pour la fixation et le traitement ultérieur. 7. Analyse représentative des données REMARQUE : Les données peuvent être visualisées et analysées à l’aide du logiciel du microscope, d’un logiciel tiers ou de programmes personnalisés. La procédure et les outils utilisés dépendent des besoins spécifiques des enquêteurs. Voici un exemple de flux de travail pour quantifier la courbure de la membrane et les changements de zone locale sur le bord d’attaque et à l’arrière des neutrophiles en migration. Ouvrez les fichiers d’imagerie avec Imaris ou Fiji pour visualiser la migration des neutrophiles en 4D et déterminer la qualité de l’expérience.REMARQUE : Imaris et Fiji peuvent lire le format d’imagerie de plusieurs marques de microscopes. Traitez les données en suivant les étapes suivantes en exécutant des scripts de code MATLAB personnalisés. Lisez les fichiers d’imagerie sélectionnés avec le package Bio-Formats28 pour MATLAB. Segmentez chaque image du volume 3D à l’aide de l’algorithme Otsu29 pour identifier les cellules individuelles. Suivre les objets identifiés sur la base du critère de déplacement minimum30. Déterminez les contours et les limites actifs de l’objet.Générez une projection maximale pour chaque objet identifié dans une période donnée. Appliquez la fonction bwboundaries dans MATLAB à la projection maximale de chaque objet identifié à partir de l’étape 7.2 pour générer 100 points limites. Optimisez les points limites identifiés avec l’algorithme de contour dynamique pour obtenir une précision de31 sous-pixel (Figure 3A) à l’aide des fonctions du package MATLAB téléchargé via http://www.iacl.ece.jhu.edu/static/gvf/. Superposez les limites de l’objet et l’indice de trajectoire de l’objet déterminé par le suivi à l’étape 7.3 avec la projection maximale de l’image d’origine pour générer une sortie d’un film superposé 2D à des fins de visualisation et de vérification manuelle. Dans la séquence superposée, sélectionnez manuellement tous les objets identifiés comme étant en migration de cellules en excluant les objets hors cellule, les objets en contact et les objets dont les limites sont incomplètes. Enregistrez les indices de suivi, les images de début et de fin de chaque trajectoire de cellule dans une feuille de calcul à utiliser comme entrée pour les étapes suivantes mises en œuvre par les scripts de code MATLAB. Suivez les points de limite de cellule de chaque image à la suivante en fonction du critère de déplacement minimum. Utilisez la fonction Polyarea dans MATLAB pour calculer l’aire soulignée par des points limites adjacents en deux périodes consécutives (Figure 3C). Si la limite de la cellule locale se déplace vers l’extérieur de la cellule, attribuez un signe positif au changement de zone. Si la limite de la cellule locale se déplace vers l’intérieur de la cellule, attribuez un signe négatif à la modification de zone. Mesurez la courbure locale de la membrane à chaque point limite de chaque image en ajustant ses points limites voisins à un cercle (5 par côté ; total 11)32 (Figure 3B). Générez des kymographes à l’aide de la fonction imagesc de MATLAB (Figures 3D,E) pour montrer les changements des caractéristiques subcellulaires au fil du temps et en relation avec la position de la cellule.