Registrierung von Kalziumtransienten in neuromuskulären Verbindungen von Mäusen mit hoher zeitlicher Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie

Das Problem der Messung schneller Kalziumwellen in erregbaren Zellen ist einer der wichtigsten und herausforderndsten Aspekte bei der Untersuchung der Signalübertragung im zentralen und peripheren Nervensystem. Calciumionen spielen eine wichtige Rolle bei der Auslösung der Freisetzung von Neurotransmittern, der synaptischen Plastizität und der Modulation der Aktivität verschiedener intrazellulärer Proteine 1,2,3,4,5. Die Untersuchung der Kalziumsignalisierung ist auch wichtig, um Wege zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen zu finden⁶. Um Veränderungen des Kalziumspiegels zu messen, werden üblicherweise fluoreszierende kalziumempfindliche Farbstoffe verwendet, und Änderungen ihres Fluoreszenzniveaus werden analysiert ^7,8,9.

Das Laden von Kalziumfarbstoffen in Zellen kann auf verschiedene Arten erreicht werden. Überwiegend werden zellpermierte Farbstoffe verwendet^10,11. In einem solchen Fall ist es jedoch nicht nur schwierig, die Konzentration eines Farbstoffs in der Zelle zu kontrollieren, sondern es ist auch schwierig, Zielzellen für die Beladung auszuwählen. Diese Methode ist nicht für die Untersuchung peripherer Nervenenden anwendbar, da der Farbstoff in postsynaptische Zellen eindringt. Stattdessen sind zellimpermeant Farbstoffe für solche Präparate besser geeignet. In diesem Fall werden die Farbstoffe durch Mikroinjektion oder durch eine Patchpipette^12,13,14 an die Zellen abgegeben. Es gibt auch eine Methode zum Laden durch einen Nervenstumpf. Die letztere Methode eignet sich am besten für neuromuskuläre Verbindungspräparate 15,16,17,18,19,20. Es ermöglicht die Färbung nur für Zellen von Interesse. Obwohl diese Methode keine genaue Bewertung der Konzentration des Farbstoffs in der Zielzelle liefert, kann die Konzentration ungefähr geschätzt werden, indem der Fluoreszenzgrad der ruhenden Zellen in Lösungen mit einer bekannten Konzentration von Calcium²¹ verglichen wird. In dieser Studie wird eine Modifikation dieser Methode vorgestellt, die auf Synapsen von Säugetieren angewendet wird.

Der Kalziumeintritt während der depolarisierenden Phase des Aktionspotentials ist ein schneller Prozess, insbesondere in der neuromuskulären Verbindung; Daher ist für seine Registrierung eine geeignete Ausrüstung erforderlich¹. Eine aktuelle Studie mit einem spannungsempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff zeigte, dass die Dauer des Aktionspotentials in der peripheren Synapse einer Maus etwa 300 μs^{beträgt 22}. Calcium transient, bewertet mit Calcium-sensitiven Farbstoffen in den peripheren Synapsen des Frosches, hat eine längere Dauer: Die Anstiegszeit beträgt etwa 2-6 ms und die Zerfallszeit beträgt etwa 30-90 ms, abhängig vom verwendeten Calciumfarbstoff^23,24. Um schnelle Prozesse mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen zu messen, werden in der Regel CCD- oder CMOS-Kameras mit schnellen und empfindlichen CCD-Matrizen eingesetzt. Diese Kameras haben jedoch den Nachteil einer niedrigen Auflösung, begrenzt durch die Größe der empfindlichen Elemente der Matrix^25,26,27,28. Die schnellsten Kameras mit ausreichender Empfindlichkeit, um sowohl Aktionspotentiale als auch Kalziumtransienten als Reaktion auf niederfrequente Stimulation von Zellen aufzuzeichnen, haben eine Abtastfrequenz von 2.000 Hz und eine Matrix mit einer Abmessung von 80 x 80²⁹. Um Signale mit einer höheren räumlichen Auflösung zu erhalten, wird konfokale Mikroskopie verwendet, insbesondere wenn es notwendig ist, einige volumetrische Änderungen im Signal^30,31,32 zu beurteilen. Es sollte jedoch bedacht werden, dass die konfokale Mikroskopie im Zeilenscanmodus eine hohe Scangeschwindigkeit aufweist, aber es gibt immer noch erhebliche Einschränkungen bei der Geschwindigkeit der Aufzeichnung schneller Prozesse bei der Erstellung eines räumlichen Bildes³³. Es gibt konfokale Mikroskope auf Basis rotierender Nipkow-Scheiben (Slit-Scanning-Mikroskopie) und Multipoint-Array-Scanner, die eine höhere Scangeschwindigkeit aufweisen. Gleichzeitig sind sie den klassischen konfokalen Mikroskopen in der konfokalen Bildfilterung unterlegen (Pinholes Crosstalk für Mikroskope mit Nipkow-Scheibe)^32,34,35. Konfokale Bildgebung mit Resonanzabtastung kann auch eine hohe räumlich-zeitliche Auflösung liefern, die für hohe zeitliche Messungen erforderlich^{ist 36}. Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass die Registrierung schwacher Fluoreszenzantworten bei hoher Abtastgeschwindigkeit bei Verwendung von Resonanztomographen hochempfindliche Detektoren wie Hybriddetektoren³⁶ erfordert.

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Erhöhung der zeitlichen Auflösung von Signalen vor, die mit der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (LSCM) aufgezeichnet wurden, unter Beibehaltung der räumlichen Auflösung³⁷. Das aktuelle Verfahren ist eine Weiterentwicklung der zuvor beschriebenen und auf die LSCM-Plattform^38,39,40 übertragenen Methoden. Dieser Ansatz erfordert keine Änderungen in der Mikroskophardware und basiert auf der Anwendung eines Algorithmus zur Aufzeichnung periodisch evozierter fluoreszierender Signale mit einer Zeitverschiebung relativ zum Zeitpunkt der Stimulation.